Vīrusveidīgo daļiņu nanotehnoloģija zāļu un diagnostikas līdzekļu transportstruktūru izstrādei

Projekts tiek īstenots ERAF 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros
Projekta vienošanās Nr. 2010/0314/2DP/2.1.1.1.0/10/APIA/VIAA/052
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr. biol. Kaspars Tārs
Plānotais kopējais projekta īstenošanas ilgums: 36 mēneši.
Projekta plānotās attiecināmās izmaksas ir 491 810 lati.
Projekta īstenošanas vieta – Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs. Kā sadarbības partneri projektā ir paredzēti SIA „LabochemLV”

Viena no aktuālākajām problēmām mūsdienu medicīnas nanotehnoloģijās ir ārstniecisko un diagnostisko materiālu specifiska  transportēšana uz noteiktiem orgāniem, audiem un šūnu tipiem. Piemēram, pretvēža ķīmijterapijā pielietojamie preparāti bieži ir ļoti toksiski arī normālajām organisma šūnām. Problēmu būtu iespējams atrisināt, atbilstošos preparātus iepakojot nanokonteineros un selektīvi novirzot tieši uz audzēja šūnām.  
Viens no perspektīvākajiem nanokonteineru kandidātiem ir vīrusveidīgās daļiņas (Virus-like particles, VLP), kas pēc būtības ir tukši, genomu nesaturoši vīrusu apvalki. Vīrusi jau dabīgi spēj atpazīt noteiktus šūnu tipus un nogādāt uz tiem kravu – vīrusa genomu. Vīrusa genomu ir tehniski iespējams aizvietot ar vēlamajiem terapeitiskajiem vai diagnostiskajiem preparātiem – oligonukleotīdiem, proteīniem, metāla nanodaļiņām, u.c. Savukārt uz VLP virsmas ir iespējams eksponēt dažādas adreses – biomolekulas, kuras atpazīst noteiktus šūnu tipus. Adreses var būt monoklonālās antivielas vai tām līdzīgi mākslīgi veidoti nelieli proteīni (piem. afivielas, antikalīni, u.c.), kas atpazīst noteiktus biomarķierus, piemēram, tādus, kuri pārsvarā ir sastopami uz noteiktu audzēju šūnu virsmām.
Projekta gaitā tiek plānots izstrādāt tehnoloģijas materiālu pakošanai VLP un to transpotēšanai uz leikocītiem, hepatocītiem un audzēju šūnām.
 
Projekta vispārīgais mērķis – terapeitisko un diagnostisko nanomateriālu piegādes nodrošināšana noteiktiem orgāniem, audiem un šūnu tipiem.  
Projekta specifiskais mērķis – jaunas tehnoloģijas un produktu izstrāde specifiskai dažādu terapeitisko un diagnostisko nanomateriālu piegādei ar vīrusveidīgo daļiņu (VLP) palīdzību hepatocītiem, leikocītiem un dažādu audzēju šūnām.
 
Lai nodrošinātu mērķu sasniegšanu, projekta ietvaros plānots īstenot šādas aktivitātes:
1.Pētniecība:
     1.1. Rūpnieciskais pētījums  
Aktivitāte tiks īstenota ar mērķi izveidot jaunus produktus un izstrādāt jaunas tehnoloģijas zāļu un diagnostikas līdzekļu transportstruktūru izveidei uz VLP pamata.  
Pētniecības aktivitāte ietvers 5 pamatposmus: VLP iegūšanu, materiālu pakošanu VLP, VLP virsmas modifikāciju, VLP testēšanu un perspektīvāko VLP izvēli.
     1.2. Eksperimentālā izstrāde:
Rūpnieciskā pētījuma rezultātā iegūto perspektīvāko VLP iegūšanas tehnoloģiju mērogošanas protokolu izstrāde
2. Pētniecības rezultātu publiskas pieejamības nodrošināšana;
3. Pētniecības rezultātu rūpnieciskā īpašuma tiesību nostiprināšana.
_________________________________________  

Atskaites:

Līdz 2013. gada 31. decembrim paveikts:

1. Izanalizēta bakteriofāga φCb5 genoma sekvence [1];
2. Izstrādāta bakteriofāga φCb5 VVD in vitro izjaukšanas un salikšanas metodika;
3. Izstrādāta metode afivielas Z_HER2:342 un peptīda DPAF ķīmiskai piesaistīšanai φCb5 fāga kapsīdām;
4. Testēta φCb5 VVD ar eksponēto Z_HER2:342 piegāde šūnu līnijā ar ekspresētu HER2 receptoru;
5. Izstrādāta tehnoloģija in vivo nukleīnskābes pakošanai mazā RNS fāga GA VVD raugu šūnās;
6. Izstrādāta tehnoloģija bakteriofāga Qβ virsmas modifikācijai ar mazmolekulāriem savienojumiem, t.sk. nikotīnu. Pret modificētajām VVD tika iegūtas antivielas, kurām tika noteikta trīsdimensionālā struktūra [2];
7. Producētas mazo RNS fāgu φCb5, Qβ, GA, fr, prr1 un pp7 VVD; sobemovīrusu RGMV, RYMV un CfMV VVD, hepatīta B serdes antigēna HBCAg VVD, kāmju poliomas vīrusa (HaPyV) VVD un kartupeļu vīrusu PVX un PVY VVD;
8. Izstrādāta tehnoloģija difterijas toksīna mRNS iegūšanai un pakošanai fāga φCb5 kapsīdās;
9. Afiviela Z_HER2:342 ir ģenētiski sapludināta ar mazo RNS fāgu AP205 un izveidotas šķīstošas mozaikālas VVD, kuras sastāv no dabīgā AP205 apvalka proteīna (CP) un CP varianta, kura c-galā pievienota Z_HER2:342 sekvence;
10. Testēta AP205 VVD ar eksponēto Z_HER2:342 piegāde divās dažādās šūnu līnijās ar ekspresētu HER2 receptoru;
11. Izstrādāta tehnoloģija magnētisko nanodaļiņu pakošanai natīvajās un ar Z_HER2:342 dekorētajās AP205 VVD;
12. Testēta AP205 VVD ar iepakotajām magnētiskajām nanodaļiņām piegāde eikariotiskajās šūnu līnijās;
13. Uzrakstīts manuskripts publicēšanai starptautiskā izdevumā par AP205 VVD izmantošanu materiālu piegādei eikariotiskajās šūnās;
14. Izpētīta RNS piesaistīšanās bakteriofāga PRR1 VVD [3];
15. Izolēts un izpētīts bakteriofāgs M, kura VVD tiks producētas projekta vajadzībām [4];
16. Izloēts un izpētīts bakteriofāgs Enc34, kura VVD tiks producētas projekta vajadzībām [5];
17. Par VVD iegūšanu un raksturošanu uzrakstīti un publicēti divi apskata raksti [6-7];
18. Izstrādāta uzlabota metodika Hepatīta B serdes antigēna (HBcAg) VVD producēšanai E.coli šūnās [8];
19. Izstrādāta metode kāmju poliomas vīrusa (HaPyV) VVD producēšanai un attīrīšanai. Daļa no pētījuma rezultātiem publicēta plašāka pētījuma kontekstā par HaPyV saistību ar limfomu audzējiem.
20. Izpētīta RNS piesaistīšanās bakteriofāga Qβ VLP [9];
21. Izstrādāta un publicēta metode bakteriofāgu fr, SP, PP7 AP205 un φCb5 VLP producēšanai raugu šūnās un metode materiālu pakošanai bakteriofāga φCb5 VLP [10].
22. Izstrādāta VLP producēšanas un attīrīšanas tehniskā dokumentācija;
23. Izstrādāta VLP izjaukšanas un salikšanas tehniskā dokumentācija;
24. Izstrādāta tehniskā dokumentācija adrešu ķīmiskai piesaistei VLP
25. Izstrādāta tehniskā dokumentācija VLP piegādei šūnu kultūrās
26. Izstrādāta tehniskā dokumentācija VLP piegādei dzīvnieku modeļos
27. Izstrādāta VLP mērogošanas tehniskā dokumentācija
28. LR patentu valdē iesniegti 4 patentu pieteikumi par VLP producēšanu un modificēšanu:

• „Modificēti HBV core nanokonteineri kā universāla platforma bioloģiska materiāla eksponēšanai”
• „Paņēmiens izvēlēta materiāla piešūšanai HBV core proteīna veidotajām nanodaļiņām”
• „Kartupeļu vīrusam PVM līdzīgo daļiņu iegūšana”;
• „Daudzziedu airenes raibuma vīrusam līdzīgo daļiņu iegūšana”

29. Pārskata periodā ir turpināts darbs pie publicēšanai iesniegtā manuskripta pilnveidošanas:

Modified bacteriophage AP205 VLPs as nanocontainers for drug delivery to HER2 overexpressing cell lines. Strods A., Cielēns I., Priede D., Petrovska R., Ose-Klinklāva V., Tārs K., Renhofa R.

1. Kazaks A., Voronkova T., Rumnieks J., Dishlers A., Tars K. Genome Structure of Caulobacter Phage phiCb5. J Virol. (2011) 85: 4628-31.
2. Tars K., Kotelovica S., Lipowsky G., Bauer M., Beerli R.R., Bachmann M., Maurer P. Different binding modes of free and carrier-protein coupled nicotine in a human monoclonal antibody. J Mol Biol. (2012), 415: 118-27.
3. Persson M., Tars K., Liljas L. PRR1 coat protein binding to its RNA translational operator. Acta cryst. (2013) D69, 367-372.
4. Rumnieks J., Tars K. Diversity of pili-specific bacteriophages: genome sequence of IncM plasmid-dependent RNA phage M. BMC Microbiol. (2012) Nov 24;12(1):277.
5. Kazaks A., Dislers A., Lipowsky G., Nikolajeva V., Tars K. Complete Genome Sequence of the Enterobacter cancerogenus Bacteriophage Enc34. J Virol. (2012) 86:11403-4.
6. Zeltins A. Construction and Characterization of Virus-Like Particles: A Review.  Mol Biotechnol (2013) 53:92–107.
7. Pushko P., Pumpens P., Grens E. Development of virus-like particle technology from small highly symmetric to large complex virus-like particle structures. Intervirology. (2013) 56:141-65
8. Berza I., Dishlers A., Petrovskis I., Tars K., Kazaks A. (2013). Plasmid dimerization increases the production of hepatitis B core particles in E. coli. Biotechnology and Bioprocess Engineering, in press.
9. Rumnieks J., Tars K. Crystal structure of the bacteriophage Qβ coat protein in complex with the RNA operator of the replicase gene. J Mol Biol. (2013) Sep 11.  [Epub ahead of print].
10. Freivalds J., Kotelovica S., Voronkova T., Ose V., Tars K., Kazaks A.Yeast-Expressed Bacteriophage-Like Particles for the Packaging of Nanomaterials. Mol Biotechnol. 2013 Jul 13. [Epub ahead of print]