Jaunu in vitro diagnostikas un prognostiskas līdzekļu izstrāde individualizētai audzēju un mitohondriālo saslimšanu ārstēšanai
Projekta nosaukums: „Jaunu in vitro diagnostikas un prognostiskas līdzekļu izstrāde individualizētai audzēju un mitohondriālo saslimšanu ārstēšanai”
Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros
Projekta identifikācijas Nr.: 2014/0021/2DP/2.1.1.1.0/14/APIA/VIAA/058
Projekta izpildes termiņš: 13 mēneši (2014.gada 1.augusts – 2015.gada 31.augusts)
Projekta kopējais finansējums: 557 484,00 EUR
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr.biol. J.Kloviņš
Projekta mērķis ir izstrādāt vairākas inovatīvas diagnostikas tehnoloģijas audzēju un mitohondriālo slimību diagnostikai un prognostikai. Rūpniecisko pētījumu ietvaros tiks noskaidrotas somatiskās mutācijas, kas saistītas ar krūts vēža terapijas iznākumu un RNS ekspresijas profils, kas ir saistīts ar hipofīzes adenomu klīniskajiem parametriem. Veicot eksperimentālās izstrādes, tiks izveidoti četri diagnostikas testi: 1) terapeitiski nozīmīgo somatisko mutāciju detektēšanai audzēja biopsijās krūts vēža pacientēm, 2) pārmantoto mutāciju noteikšanai melanomas riska prognozēšanai, 3) RNS ekspresijas tests hipofīzes audzēju terapijas izvēlei un 4) mitohondriālo patoloģiju ģenētiskās diagnostikas tests. Izstrādātās metodes un testi tiks sagatavoti licencēšanai jaunu diagnostikas pakalpojumu veikšanai.
Informācija publicēta 03.08.2014.
Periods: 01.08.2014.-31.10.2014.
Aktivitāte Nr.1.1. Krūts vēža somatisko mutāciju klonālās dinamikas izpēte
Izmantojot COSMIC un ICGC datu bāzes, atlasītas 202 biežāk izplatītākās krūts vēža somatiskās mutācijas 91 gēnā, uz kā pamata izstrādāts Ion AmpliSeqTM indivudualizētais panelis, kura dizains gala variantā ar 120 amplikoniem pārklāj 194 no atlasītajām mutācijām. Izstrādāti kritēriji krūts vēža pacientu iekļaušanai pētījumā un metodoloģija biomateriāla ievākšanai un ievākti pirmie biomateriāla komplekti no četrām krūts vēža pacientēm. Iesākti nepieciešamie priekšdarbi, optimālās metodologijas izvēle un atstrādāšana turpmākai DNS izdalīšanai no pacientu biomateriāla, DNS kvantitēšani, amplikonu bibliotēku konstruēšanai, jaunās paaudzes sekvenēšanas veikšanai un sekvenču datu analīzei.
Aktivitāte Nr.1.2. Hipofīzes adenomu mRNS ekspresijas profilēšana
Veikti plaši pētījumi literatūrā, kuru laikā analizēta literatūrā sastopamā informācija par hipofīzes adenomu terapeitisko mērķu, hormonu produkcijas un sekrēcijas, kā arī onkogēno marķieru mRNS ekspresijas profiliem. Turpināta pacientu iesaiste pētījumā, kā arī sagatavoti pirmie paraugi mRNS profilēšanai. Konstruēta pirmā nākamās paaudzes sekvencēšanas bibliotēka un analizēti preliminārie sekvencēšanas rezultāti.
Aktivitāte Nr.2.1. Krūts vēža somatisko mutāciju testa izstrāde
Optimozēta metode DNS izdalīšanai no pacientu biopsijām un iesākts darbs pie metodoloģijas izstrādes un validēšanas castPCR mutāciju testa izveidei.
Aktivitāte Nr.2.2. Melanomas riska noteikšanas testa izstrāde
Balstoties uz literatūras datiem, pārskata periodā tika atlasīti tie gēni, kuros identificētās ģenētiskās izmaiņas uzrāda pārliecinošu saistību ar melanomas risku, kā arī apzināti tie gēnu reģioni, kuru saistība ar melanomu ir visaugstākā. Uzsākta uz HaloPlex platformas balstītā testa dizaina izstrāde ar Agilent SureDesign rīku.
Aktivitāte Nr.2.3. Diagnostiska testa izstrāde hipofīzes adenomu optimālas terapijas izvēlei
Analizēta literatūrā sastopamā informācija par izvēlēto marķieru ietekmi uz hipofīzes adenomu prognostiku un terapijas efektivitāti. Turpināta pacientu iesaiste pētījumā testa validācijas grupai. Sekvencēta pirmā nākamās paaudzes sekvencēšanas bibliotēka un analizēti pirmējie iegūtie rezultāti. Turpināts darbs pie zāļu efektivitātes testa izstrādes hipofīzes adenomu šūnu līnijās.
Aktivitāte Nr.2.4. Mitohondriālo patoloģiju DNS diagnostikas testa izstrāde
Aktivitātes ietvaros ir plānots izveidot ātru un efektīvu diagnostisko sistēmu, kas ir balstīta uz pilna garuma mtDNS sekvenēšanu. Pirmajā etapā bija nepieciešams izvēlēties praimeru pārus un polimerāzi ar mērķi, lai iegūtu mt DNS PCR fragmentus, ko izmantot vēlākai sekvenēšanai. Tādā veidā aktivitātes pirmajā posmā ir izdevies atlasīt un dizainēt nepieciešamos oligonukleotīdu pārus un optimizēt PCR reakciju, kā rezultātā ir iespējams sintezēt 12 aptuveni vienāda garuma savstarpēji pārklājošos mtDNS fragmentus.
Periods: 01.11.2014.-31.01.2015.
Aktivitāte Nr.1.1. Krūts vēža somatisko mutāciju klonālās dinamikas izpēte
Turpināta jaunu krūts vēža pacienšu iesaiste pētījumā un ievākti piecu pacienšu biomateriāla komplekti. Izdalīta un kvantitēta gDNS no krūts vēža biomateriāla komplektiem. Konstruētas pirmās sešas jaunās paaudzes sekvenēšanas amplikonu bibliotēkas no vienas pacientes pirms un pēc-ķīmijterapijas biopsiju gDNS. Veikta konstruēto bibliotēku klonāla amplificēšana uz Ion Sphere™ daļiņām un sekvenēšana, izmantojot Ion PGM™ platformu.
Aktivitāte Nr.1.2. Hipofīzes adenomu mRNS ekspresijas profilēšana
Veikta iepriekš atlasītās paraugkopas mRNS ekspresijas profilēšana hipofīzes adenomām, kā arī būtiskāko ar hipofīzes adenomu attīstību saistīto ģenētisko faktoru profilēšana. Iegūtie rezultāti analizēti kontekstā ar nākamās paaudzes sekvencēšanas un literatūras datiem, kā rezultātā iegūti iespējamie ekspresijas profilu analizēšanas paneļu varianti. Darbs pie pacientu iesaistes, paraugkopas paplašināšanas un ekspresijas profilēšanas tiks turpināts turpmākajā projekta norises periodā.
Aktivitāte Nr.2.1. Krūts vēža somatisko mutāciju testa izstrāde
Pētījumā iesaistītas sešas krūts vēža pacientes, no kurām ievākts krūts vēža biomateriāls. Veikta gDNS izdalīsana un kvantitēšana krūts vēža paraugiem. Turpināts darbs pie metodoloģijas izstrādes un atstrādāšanas castPCR mutāciju testa izveidei.
Aktivitāte Nr.2.2. Melanomas riska noteikšanas testa izstrāde
Pabeigta melanomas riska noteikšanas testa dizaina izstrāde. Panelī iekļauti seši pilna garuma gēni (BAP1, TERT, POT1, CDKN2A, CDK4, MC1R) un 60 viena nukleotīda polimorfismi no vēl 15 gēniem (SETDB1, PARP1, CASP8, MITF, SLC45A2, IRF4, BRAF, TYRP1, MTAP, TYR, ATM, OCA2/HERC2, ASIP, MX2, MLA2G6). Kopējais analizējamais sekvenču garums panelī ir 190,565 kbp. Darbs turpinās pie DNS paraugu analīzes.
Aktivitāte Nr.2.3. Diagnostiska testa izstrāde hipofīzes adenomu optimālas terapijas izvēlei
Veikti pētījumi zāļu efektivitātes validācijas testa izstrādes jomā, kuru ietvaros izvērtēta iegūto hipofīzes adenomu morfofizioloģiska un funkcionāla raksturošana. Turpināta arī nākamās paaudzes bibliotēku konstruēšana, lai uzlabotu terapijas efektivitātes panelī iekļaujamo marķieru spektru.
Aktivitāte Nr.2.4. Mitohondriālo patoloģiju DNS diagnostikas testa izstrāde
PCR reakcijas optimizācija pirmajā projekta aktivitātes posmā ļāva attīstīt nākamo posmu, t.i., veikt praimeru dizainu, kas nodrošinātu sekvenēšanas reakciju. Ņemot vērā mitohondriāla DNS (mtDNS) cirkulāro struktūru un augsto mutāciju skaitu, tika atlasīti oligonukleotīdi, kas sekvenēšanas gaitā nodrošina mtDNS pārklājumu vismaz četras reizes. Katram sintētiskajam oligonukleotīdam tika veikta sekvenēšanas reakcijas optimizācija, lai sasniegtu universālus reakcijas apstākļus un vienādu oligonukleotīdu piesaistīšanās temperatūru. Aktivitātes otrajā posmā ir izdevies atlasīt un dizainēt 96 sekvenēšanas oligonukleotīdus.
Periods: 01.02.2015.-31.05.2015.
Aktivitāte Nr.1.1. Krūts vēža somatisko mutāciju klonālās dinamikas izpēte
Turpināta jaunu krūts vēža pacienšu iesaiste pētījumā un ievākti četru pacienšu biomateriāla komplekti. Izdalīta un kvantitēta DNS no krūts vēža biomateriāla komplektiem. Konstruētas 24 jaunās paaudzes sekvenēšanas amplikonu bibliotēkas no četru pacienšu pirms un pēc-ķīmijterapijas biopsiju DNS. Veikta konstruēto bibliotēku kvalitātes kontrole un koncentrācijas mēŗījumu un kvalitātes kritērijiem atbilstošās bibliotēkas multipleksētas, klonāli amplificētas uz Ion Sphere™ daļiņām un sekvenētas, izmantojot Ion PGM™ platformu. Veikta sekvenēšanas datu analīze un konstatēto mutāciju validēšana, veicot Sangera sekvenēšanu.
Aktivitāte Nr.1.2. Hipofīzes adenomu mRNS ekspresijas profilēšana
Projekta aktivitātē 1.2. izveidotas un ar NGS metodi sekvencētas piecas hipofīzes adenomu pacientu bibliotēkas. Uzsākta datu analīze ar mērķi noskaidrot gēnu ekspresijas individuālo variabilitāti kā arī gēnus, kuru mRNS ekspresijas līmeni visvairāk izmainījusi terapijā lietotie medikamenti. Veikta papildus pacientu iesaiste un klīnisko datu detalizēta reģistrācija. Paraugi no šiem pacientiem tiks sagatavoti, dati analizēti un pievienoti mRNS profilēšanas pētījumam tuvākajā projekta norises periodā.
Aktivitāte Nr.2.1. Krūts vēža somatisko mutāciju testa izstrāde
Pētījumā iesaistītas vēl piecas krūts vēža pacientes, no kurām ievākts krūts vēža biomateriāls. Veikta DNS izdalīšana un kvantitēšana krūts vēža paraugiem. Balstoties uz jau nosekvenēto pacientu jaunās paaudzes sekvenēšanas datu (aktivitāte Nr.1.1.) analīzi, izvēlētas pirmās divas mutācijas iekļaušanai uz castPCR balstītā testsistēmā un tika pārbaudīta šo testu spēja detektēt mutāciju pacientu audzēju biomateriāla paraugos.
Aktivitāte Nr.2.2. Melanomas riska noteikšanas testa izstrāde
Veikta HaloPlex platformas testēšana, sekvenējot paaugstināta riska melanomas pacientu DNS paraugus. Atrastas pirmās izmaiņas melanomas riska gēna BAP1. Tiek skaidrota atrasto izmaiņu nozīme un loma melanomas attīstībā, kā arī turpinās citu pārējo melanomas riska gēnu analīze.
Aktivitāte Nr.2.3. Diagnostiska testa izstrāde hipofīzes adenomu optimālas terapijas izvēlei
Projekta aktivitātē 2.3. turpināta validācijas grupas izveide un klīnisko datu ievākšana un sistematizēšana. Iepriekšējā periodā iesaistīto validācijas grupas pacientu paraugi sagatavoti sekvencēšanai – veikta bibliotēku konstruēšana, pārbaudīta to kvalitāte un salīdzinātu kvalitatīvu bibliotēku veidošanas atkārtojamības variabilitāte. Veikta alternatīvā splaisinga noteikšanas validācija izmantojot starpparaugu salīdzinājumu. Validācijas eksperimenti tiks turpināti turpmākajā projekta periodā.
Aktivitāte Nr.2.4. Mitohondriālo patoloģiju DNS diagnostikas testa izstrāde
Sadarbojoties ar ārstiem-ģenētiķiem un neirologiem tika atlasīta pacientu grupa, kuriem pastāv aizdomas par mitohondriālo patoloģiju, balstoties uz bioķīmiskajiem parametriem, un/vai klīniskajiem rādītājiem. Atbilstoši sagatavotajam protokolam tika veikta mitohondriālās DNS sekvenēšana visiem paraugiem. Sagatavots patenta pieteikums un iesniegts Eiropas patentu birojā (EPO – European Patent Office). Projekta nobeigumā turpinās darbs pie mitohondriālo haplogrupu analīzes un medicīniskās tehnoloģijas izstrādes.
Periods: 01.06.2015.-31.08.2015.
Aktivitāte Nr.1.1. Krūts vēža somatisko mutāciju klonālās dinamikas izpēte
Turpināta jaunu krūts vēža pacientu iesaiste pētījumā un biomateriāla vākšana. No biomateriāla paraugiem izdalīta un kvantitēta DNS. Konstruētas jaunas NGS amplikonu bibliotēkas un veikta to sekvenēšana, izmantojot IonPGMTM platformu. Ar NGS atrastās mutācijas vizuāli verificētas (IGV) un validētas, izmantojot Sangera sekvenēšanu. Veikta mutāciju dinamikas korelācija ar pacientu klīniskajiem datiem un ķīmijterapijas efektivitāti raksturojošiem rādītājiem.
Aktivitāte Nr.1.2. Hipofīzes adenomu mRNS ekspresijas profilēšana
Projekta aktivitātē 1.2. sagatavotas divas publikācijas, kas iesniegtas starptautiski citējamos žurnālos: Stem Cell Research (ietekmes faktors 3.693) ar nosaukumu: “Functional characteristics of mesenchymal stem cells from pituitary adenomas” un European Journal of Endocrinology ar (ietekmes faktoru 4.069 “Polymorphisms in MEN1, SSTR5 and DRD2 genes are associated with occurrence and characteristics of pituitary adenomas” tādējādi sasniedzot projekta aktivitātes rezultatīvos rādītājus.
Aktivitāte Nr.2.1. Krūts vēža somatisko mutāciju testa izstrāde
Balstoties uz krūts vēža somatisko mutāciju klonālās dinamikas izpēti un korelāciju ar ķīmijterapijas efektivitāti raksturojošiem klīniskajiem rādītājiem, tika atlasītas mutācijas ar prognostisku nozīmību iekļaušanai somatisko mutāciju testa prototipā. Izveidots somatisko mutāciju detekcijas castPCR panelis un raksturoti tā tehniskie parametri. Paralēli turpināta jaunu krūts vēža pacientu iesaiste pētījumā un audzēja biopsiju vākšana, uz kurām veikta testa sistēmas pārbaude plašākā populācijā.
Aktivitāte Nr.2.2. Melanomas riska noteikšanas testa izstrāde
Izstrādāta diagnostiska metode un testa prototips melanomas riska noteikšanai un paaugstināta riska personu atklāšanai. Metodikā ir iekļauti gan augsta riska melanomas gēni (CDKN2A, CDK4, BAP1, TERT, POT1), gan salīdzinoši zemāka riska gēni (MITF, MC1R). Līdz ar to iekļauto gēnu spektrs aptver gan klasiskos melanomas riska gēnus (CDKN2A un CDK4), gan tādus gēnus, kuru saistība ar paaugstinātu melanomas attīstības risku ir parādīta tikai pēdējos gados (MITF, BAP1, TERT, POT1), ļaujot izmantot metodiku ne tikai pārmantotās melanomas gadījumā, bet arī pacientiem ar atipisko nevusu un melanomas sindromu, ar vairākām primārām melanomām, gados jauniem pacientiem, personām ar atipiskiem nevusiem un palielinātu dzimumzīmju skaitu.
Aktivitāte Nr.2.3. Diagnostiska testa izstrāde hipofīzes adenomu optimālas terapijas izvēlei
Projekta aktivitātē 2.3. pabeigta licencējamas metodes izstrāde adenohipofīzes adenomu medikamentozās terapijas prognostiskās efektivitātes noteikšanai un izstrādāts testa prototips, lai nodrošinātu uzlabotu hipofīzes adenomas pacientu veselības aprūpi. Tests nosaka septiņu gēnu ekspresiju hipofīzes adenomas audu materiālā un dod iespēju ārstam veikt informētu medikamenta un tā devas izvēli pielāgotu katra pacienta individuālajām vajadzībām.
Aktivitāte Nr.2.4. Mitohondriālo patoloģiju DNS diagnostikas testa izstrāde
Mitohondriālo haplogrupu noteikšana
50 neradnieciskām personām Latvijas populācijā tika noteiktas haplogrupas, un aprakstītas biežākās mutācijas, kas veido šīs haplogrupas Latvijā.
Dažādu audu mtDNS heteroplazmijas salīdzinājums
Projekta aktivitātes noslēguma etapā tika analizēti klīniskie gadījumi, kad mutācijas heteroplazmijas dēļ nebija nosakāmas paraugos, kas iegūti no perifērajām asinīm. Vairākiem pacientiem pēc muskuļu biopsijas, ar samazinātu vai nevienmērīgu sukcinātdehidrogenāzes aktivitāti morfoloģiskajos preparātos tika veikta paralēla mtDNS sekvenēšana paraugos, kas ņemti no asinīm un muskuļiem. Nevienam no pacientiem analizētajos preparātos mutācijas neatšķīrās.
Medicīniskā tehnoloģija
Izstrādājot medicīnisko tehnoloģiju “Pilna mtDNS sekvenēšana”, notika darbs pie metodes kvalitātes kontroles. Netika novērotas alēļu biežuma atšķirības analizētajos paraugos. Viltus pozitīvas mutācijas netika atklātas. Sagatavotai tehnoloģijai jūtīgums un specifiskums ir >95%.
Informācija sagatavota: 30.04.2015.