Pētījumi jaunu ģenētisko un imūndetekcijas diagnostikas metožu izveidei
Projekta nosaukums: „Pētījumi jaunu ģenētisko un imūndetekcijas diagnostikas metožu izveidei”
Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros
Projekta identifikācijas Nr.: 2013/0042/2DP/2.1.1.1.0/13/APIA/VIAA/002
Projekta izpildes termiņš: 20 mēneši (2014.gada 1.janvāris – 2015.gada 31.augusts)
Projekta kopējais finansējums: 374 746,02 EUR
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr.biol. J.Kloviņš
Projekta mērķis ir rūpnieciskā pētījuma ietvaros izstrādāt vairākas inovatīvas diagnostikas tehnoloģijas. Pirmkārt, paredzēts izstrādāt diagnostikas metodi biežāk sastopamo trisomiju un iedzimto slimību prenatālai diagnosticēšanai, kā materiālu izmantojot mātes asins paraugu. Otrkārt, paredzēts izstrādāt jaunas metodes multipleksai vairāku antivielu noteikšanai asinīs ar imūndetekcijas palīdzību. Izstrādātās metodes un tehnoloģijas būs piemērotas diagnostikas pakalpojumu veikšanai.
Informācija publicēta: 06.01.2014.
Atskaites
Līdz 2014.gada martam:
Aktivitāte Nr.1. Metodes izstrāde neinvazīvai prenatālai aneiploīdiju diagnosticēšanai
Šīs aktivitātes ietvaros projekta izpildes pirmajā pārskata periodā tika veikti eksperimenti, kas saistīti ar vispiemērotākās asins paraugu ievākšanas un augļa brīvās DNS izdalīšanas metožu izvēli. Šo eksperimentu ietvaros tika izmēģināti dažādi paraugu ievākšanas stobriņi un rezultāti uzrādīja, ka stabilākos rādītājus izdodas iegūt no sorbiņiem, kas satur leikocītu stabilizācijas reaģentu, savukārt EDTA saturošu stobriņu izmantošana ir pieļaujama tikai tad ja parauga tālāk apstrāde tiek veikta tūlīt pēc parauga ievākšanas. Dažādu brīvās DNS izdales metožu salīdzināšana atklāja, ka specializētā reaģentu komplekta izmantošana ir tikpat efektīva kā citas, tai skaitā BMC, izstrādātās metodes.
Šajā projekta posmā tika arī uzsākta sadarbība ar Latvijas vadošajiem ginekologiem un uzsākta sekvencēšanas eksperimentu metodiku sagatavošana.
Aktivitāte Nr.2. Metodes izstrāde multipleksai imūndetekcijai
Šajā pārskata periodā tika veikta intensīva literatūras datu izpēte ar mērķi izvēlēties multipleksai imūndetekcijai vispiemērotākos antivielu epitopus, kā arī vispiemērotākās pozitīvās kontroles antivielas. Paralēli tika apzināti arī šo reaģentu iespējamie piegādātāji un metodes, ar kuru palīdzību šie reaģenti tiks uznesti uz to nesējiem.
Līdz 2014. gada jūnijam:
Aktivitāte Nr.1. Metodes izstrāde neinvazīvai prenatālai aneiploīdiju diagnosticēšanai
Šīs aktivitātes ietvaros tika izstrādāta un pilnveidota nākamās paaudzes sekvencēšanas metodika un kuras tika balstīti pirmie sekvencēšanas eksperimenti. Šo eksperimentu ietvaros tika sekvencēta no plazmas izdalītā cilvēka brīvā DNS. Iegūto sekvenču analīze izmantojot bioinformātikas metodes atklāja, ka 99% no tā ir ar augstu ticamības līmeni attiecināmas uz cilvēka genomu un iegūtais sekvenču pārklājums atbilst plānotajam. Kopumā iegūtie rezultāti pierādīja, ka BMC pieejamā aparatūra un tehnoloģijas ir pielietojamas šāda tipa eksperimentu veikšanai. Turpinot eksperimentālās izstrādes daļu, tika sagatavots mākslīgs „brīvās DNS” maisījums, kurā no vesela cilvēka iegūtais paraugs tika bagātināts ar cilvēka 21 hromosomai atbilstošiem DNS fragmentiem. Izveidotais paraugs tiks sekvencēts turpmākajos projekta posmos, pēc sekvencēšanas un datu analīzes metodiku uzlabošanas.
Šajā projekta posmā tika arī saņemti pirmie paraugi „Streck” ražotajos leikocītu stabilizācijas reaģentu saturošajos asins paraugu ievākšanas stobriņos.
Aktivitāte Nr.2. Metodes izstrāde multipleksai imūndetekcijai
Šajā periodā tika izvēlēti multipleksai imūndetekcijai vispiemērotākie antivielu epitopi, kā arī vispiemērotākās pozitīvās kontroles antivielas, kā arī tika izstrādātas metodikas šo reaģentu uznešanai uz to nesējiem.
Līdz 2014. gada septembrim:
Aktivitāte Nr.1. Metodes izstrāde neinvazīvai prenatālai aneiploīdiju diagnosticēšanai
Šīs aktivitātes ietvaros iepriekšējos projekta posmos izveidotais paraugs ar cilvēka 21 hromosomai atbilstošiem DNS fragmentiem tika sekvencēts un iegūtie dati tika analizēti izmantojot statistiskās analīzes metodes. Iegūtie rezultāti, nebija viennozīmīgi interpretējami, jo nesniedza iespēju bagātināto paraugu atšķirt no kontroles paraugiem, bet uzrādīja, ka izmantojot izvēlēto pieeju, tie ir atkārtojami, jo kontroles paraugi būtiski neatšķīrās no iepriekš sekvencētajiem paraugiem. Veicot detalizētus aprēķinus tika noskaidrots, ka šie negatīvie rezultāti bija radušies dēļ neprecīzi sagatavota ar cilvēka 21 hromosomai atbilstošiem DNS fragmentiem bagātināta parauga. Līdz šim brīdim ir sagatavoti papildus mākslīgie „brīvās DNS” maisījumi, ar dažāda līmeņa „bagātinājumu”, kā arī uzsākti to sekvencēšanas eksperimenti.
Aktivitāte Nr.2. Metodes izstrāde multipleksai imūndetekcijai
Šajā periodā tika veikta aptauja par diagnostikas laboratorijās pieejamo nolases iekārtu klāstu un par vispopulārāko tika atzīta „Luminex 100/200 analyzer”. Nākamajā projekta posmā plānots izvērtēt iespējas izstrādājamo metodi balstīt uz šai iekārtai piemērotiem nesējiem, kā arī uzrunāt potenciālos sadarbības partnerus par iespēju validēt izstrādāto metodi.
Līdz 2014.gada decembrim
Aktivitāte Nr.1. Metodes izstrāde neinvazīvai prenatālai aneiploīdiju diagnosticēšanai
Šajā projekta posmā tika veikta iepriekš sagatavoto mākslīgo „brīvās DNS” maisījumu, kas dažādos līmeņos „bagātināti” ar cilvēka 21 hromosomai atbilstošiem DNS fragmentu, analīze. Iegūtie rezultāti apliecināja, ka, izmantojot mūsu izvēlēto pieeju, metodes un iekārtas, 21 hromosomas triploidiju ir iespējams identificēt pat tad ja paraugi bija bagātināti tikai ar 5% mākslīgā maisījuma, kas ir pietiekami, lai varētu veiksmīgi veikt analīzi ~95% gadījumu. Pēc šo – apstiprinošo rezultātu ieguves tika uzsākta pirmo, no Latvijas vadošajiem ginekologiem saņemto paraugu, kas tika ievākti „Streck” ražotajos leikocītu stabilizācijas reaģentu saturošajos asins ievākšanas stobriņos, analīze. Iegūtie rezultāti apliecināja, ka neviens no paraugiem nebija no grūtniecības ar kādu no aneiploidijām un šie paraugi ir piemēroti nākotnes analīžu statistiskās ticamības aprēķinu bāzes veidošanai.
Bez iepriekš minētajiem paraugiem, šajā projekta posmā tika saņemts arī pirmais izstrādātas metodes in vivo validācijas paraugs, no grūtniecības ar apstiprinātu 21. hromosomas trisomijas diagnozi. Analīzes gaitā iegūtie rezultāti apstiprināja iepriekš uzstādīto diagnozi, tādējādi apliecinot, ka izstrādātā metode ir praktiski pielietojama medicīniskajā diagnostikā.
Paralēli veicamajām analīzēm tika turpināta arī materiālu un reaģentu tirgus izpēte, kuras ietvaros tika identificēta virkne ar alternatīviem piegādātājiem. Šo piegādātāju produkti bija ar ievērojami zemāku cenu, kam ir potenciāls samazināt, analīzes pašizmaksu, bet neviens no tiem nebija atrodams iekārtu ražotāju rekomendāciju sarakstos. Tādēļ projekta turpmākajos posmos tiks uzsākti jauno reaģentu izmēģinājumi.
Aktivitāte Nr.2. Metodes izstrāde multipleksai imūndetekcijai
Šajā periodā tika apzināti potenciālie nesēju piegādātāji, kā arī izpētīts to un izvēlēto antigēnu sasaistes reaģentu klāsts. Procesa gaitā tika apzinātas nesējiem nepieciešamās fizikālās un ķīmiskās īpatnības, kā arī izpētīts, kādas modifikācijas būs jāveic izvēlētajiem antigēniem, lai palielinātu to piesaistes efektivitāti. Paralēli, tika izveidots validācijas plāns izstrādāto metodes pārbaudei.
Līdz 2015.gada martam
Aktivitāte Nr.1. Metodes izstrāde neinvazīvai prenatālai aneiploīdiju diagnosticēšanai
Šajā projekta posmā tika turpināta iepriekš veiksmīgi uzsāktā sadarbība ar Latvijas vadošajiem ginekologiem. Sadarbības ietvaros tika saņemti 30 asins paraugi, kas tika ievākti „Streck” ražotajos leikocītu stabilizācijas reaģentu saturošajos asins ievākšanas stobriņos, un tiem, metodes validācijas analīzes ietvaros, tika veikta zema pārklājuma cirkulējošās DNS sekvencēšana. Veicot iegūto datu statistisko analīzi tika secināts, ka rezultāti ievērojami variē no parauga uz paraugu, tādēļ atsevišķos gadījumos nebija iespējams pārliecinoši noteikt aneiplpidiju statusu. Ar mērķi, risināt identificēto problēmu, uzlabot datu analīzes procesu un vairot iegūstamo rezultātu ticamību, tika nolemts, turpmākajos projekta posmos izstrādāt metodi, kas ļautu, analīzes gaitā, mātes brīvā cirkulējošā DNS paraugā noteikt augļa DNS proporcionālo koncentrāciju.
Paralēli aprakstītajam tika veikti arī iepriekšējos projekta posmos identificēto alternatīvo materiālu un reaģentu izmēģinājumi. Izmēģinājumu rezultātā tika noskaidrots, ka alternatīvās magnētiskās DNS izmēra atlases lodītes ir savietojamas ar projekta gaitā izstrādāto metodiku, savukārt, lai izvērtētu bibliotēku sagataves reaģentu piemērotību, ir nepieciešams veikt papildus konsultācijas ar reaģentu ražotāju.
Aktivitāte Nr.2. Metodes izstrāde multipleksai imūndetekcijai
Šajā projekta posmā veikta celiakijas slimībā iesaistīto antigēnu – deamidēta gliadīna (DGP) un audu transglutamināzes (tTG) piesaiste pie mikrolodītēm celiakijas IgG un IgA autoantivielu imūndetekcijai, kā arī diabētā iesaistīto antigēnu- insulīna un ZnT8 piesaiste pie mikrolodītēm IgG autoantivielu imūndetekcijai. Celiakijas un diabēta antigēnu piesaistei tika izvēlētas mikrolodītes ar brīvām karboksil- grupām. Izmantojot EDC/NHS reakciju, antigēnu amino grupas tika kovalenti piesaistītas pie mikrolodīšu karboksil-grupām. Lai iegūtu mikrolodītes ar augstu proteīna piesaistes efektivitāti tika izmēģināti dažādi buferi un dažādas antigēnu koncentrācijas (100, 50, 10, 5 un 1 ug uz 1 ml reakcijas). Lai pārbaudītu, vai šo proteīnu piesaiste notika veiksmīgi, DGP un tTG mikrolodītes sākumā tika inkubētas ar veselo cilvēka serumu (kā negatīvā kontrole) vai celiakijas slimnieku serumu (ar jau zināmo IgA vai IgG autoantivielu koncentrāciju), kam sekoja otra inkubācija ar FITC iezīmētām anti-IgG vai anti-IgA antivielām. Celiakijas imūndetekcija parādīja, ka mikrolodītes, pie kurām tika piesaistītas 50 un 10 ug DGP un tTG, spēj efektīvi atpazīt serumā esošās autoantivielas. Kaut gan te jāmin, ka pie proteīna augstākās koncentrācijas (50 ug uz ml) ir nedaudz augstāks fons veselo cilvēku serumā. Līdz ar to turpmākām imundetekcijām tika izvēlētas mikrolodītes ar proteīnu 10 ug uz ml. Celiakijas imūndetekcijai līdzīgie rezultāti uzrādījās, izmantojot arī ZnT8 un insulīna mikrolodītes diabēta autoantivielu imūndetekcijai. Šobrīd darbs turpinās pie abu minēto imūndetekcijas paņeļu validācijas, paplašinot celiakijas, diabēta un veselo cilvēku seruma paraugu skaitu.
Līdz 2015.gada jūnijam
Aktivitāte Nr.1. Metodes izstrāde neinvazīvai prenatālai aneiploīdiju diagnosticēšanai
Šajā projekta posmā tika turpināts darbs pie iepriekš iesāktās metodes izstrādes, kas ļautu, analīzes gaitā, mātes brīvā cirkulējošā DNS paraugā noteikt augļa DNS proporcionālo koncentrāciju. Tās ietvaros tika plānots multipleksas reakcijas ietvaros amplificēt 30 genoma reģionus, kas satur bieži sastopamus polimorfismus, veikt šo amplifikācijas produktu un cirkulējošās DNS vienlaicīgu sekvencēšanu, identificēt polimorfismus, kas hetrozigotiskā stāvoklī ir sastopami tikai auglim un veikt identificēto polimorfismu kvantitatīvo analīzi. Tā kā oligonukleotīdu dizains tika paveikts iepriekšējā atskaites perioda ietvaros, tad šis darbu posms tika uzsākts ar to sintēzes pasūtījuma sagatavošanu un veikšanu. Laika posmā pēc minēto reģentu saņemšanas tika veikta virkne vienlaicīgās amplifikācijas reakcijas efektivitātes un kvalitātes novērtēšanas eksperimentu. No iegūtajiem rezultātiem tika secināts, ka visu izvēlēto genoma rajonu amplifikācija noris apmierinošā līmenī, un, ka iegūtie produkti ir piemēroti nākamās paaudzes sekvencēšanai un augļa DNS proporcionālās koncentrācijas noteikšanai. Šim pozitīvajiem atzinumam sekoja paša sekvencēšanas un kvantificēšanas eksperimenta metodiskās daļas izstrāde. Tās ietvaros tika veikti koncentrāciju aprēķini, ar mērķi izstrādāt formulu pēc kuras būtu iespējams sabalansēt amplifikācijas produktu un cirkulējošās DNS daudzumu, tādejādi nodrošinot, ka analīzes rezultātā kāda ko komponentēm nenomāc otru. Atskaites posma noslēgumā iegūtā formula tika pielietota praksē, veicot sekvencēšanas eksperimentu uz vairākiem no iepriekš iegūtajiem paraugiem.
Šajā laikā turpinājās arī konsultācijas ar alternatīvo bibliotēku izveides reaģentu ražotāju. Diemžēl šo konsultāciju rezultātā netika rasts risinājums mūsu identificētajām metodiskajām problēmām, tādēļ turpmākajā mūsu darbā tiks izmantoti tikai tie bibliotēku izveides reaģenti, kurus rekomendē iekārtu ražotājs.
Tā kā visi līdz šim iegūtie eksperimentālie rezultāti bija pozitīvi un apstiprināja projektā izvirzīto mērķu sasniedzamību, tika uzsākta visu projekta gaitā veikto darbu aprakstu apkopošana ar mērķi izveidot jaunās sekvencēšanas tehnoloģijas aprakstu un starptautiski atzītas publikācijas manuskriptu.
Aktivitāte Nr.2. Metodes izstrāde multipleksai imūndetekcijai
Saskaņā ar iepriekšējā atskaites posmā gūtajām atziņām par nepieciešamību validēt abus imūndetekcijas paneļus, šajā posmā tika uzsākta piemērotu seruma paraugu atlase no Valsts iedzīvotāju genoma datu bāzē pieejamā paraugu klāsta. Šo darbību rezultātā tika atlasītas trīs neatkarīgas paraugu kopas, kas attiecīgi saturēja celiakijas slimnieku, diabēta slimnieku un veselu cilvēku paraugus. Celiakijas un kontroles pacientu serumi tika pārbaudīti uz deamidēta gliadīna (DGP), audu transglutamināzes (tTG) IgA un IgG tipa autoantivielu klātbūtnes. Savukārt latentā diabēta un kontroles pacientu serumi tika pārbaudīti uz ZnT8, glutamāta dekarboksilāzes (GADA), Langerhansa saliņu antigēna (IA-2) un insulīna autoantivielu klātbūtni. Par cik celiakijas panelim nav pieejami references standarti cilvēka aTG un DGP proteīniem, pozitīvās un negatīvās kontroles tika iegūtas no antivielu negatīviem un pozitīviem pacientu serumiem, un arbitrārās vienības tika piešķirtas paneļa izstrādes laikā.
Iegūtie rezultāti apstiprināja, ka izveidotā imūndetekcijas tehnoloģija ir piemērota pielietošanai diagnostiskos nolūkos. Turpmākajos projekta posmos eksperimentālie rezultāti tiks apkopoti ar mērķi izstrādāt metodes Tehnoloģijas aprakstu.
Aktivitāte Nr.3. Pētniecības rezultātu rūpnieciskā īpašuma tiesību nostiprināšana
Šīs projekta aktivitātes ietvaros tika turpināta patentējamo tehnoloģiju un metodiku aprakstu apkopošana un veidots patenta teorētiskā pamatojuma apraksts.
Līdz 2015.gada augustam
Aktivitāte Nr.1. Metodes izstrāde neinvazīvai prenatālai aneiploīdiju diagnosticēšanai
Šajā projekta posmā pārsvarā tika veikti darbi pie atsevišķu metodes parametru optimizācijas. Tika noteikts optimālais amplifikācijas ciklu skaits cirkulējošās DNS bibliotēku sagatavošanas posmā, tika izvērtēta oligonukleotīdu savstarpējās koncentrācijas attiecības ietekme uz gala produktu iznākumu augļa DNS proporcionālās koncentrācijas noteikšanā, tika veikti aprēķini kuru rezultātā tika uzlabota amplifikācijas produktu un cirkulējošās DNS daudzuma sabalansēšanas formula, kā arī tika veikta virkne uzlabojumu sekvencēšanas datu analīzes un statistiskās apstrādes procesā. Tuvojoties projekta noslēgumam īpašā uzmanība tika veltīta visu projekta gaitā iegūto zināšanu apkopošanai un sistematizācija, kā rezultātā tika izveidots jaunas sekvencēšanas tehnoloģijas apraksts, kā arī tika intensīvi strādāts pie starptautiski atzītas publikācijas manuskripta teksta un attēlu sagatavošanas.
Aktivitāte Nr.2. Metodes izstrāde multipleksai imūndetekcijai
Šīs aktivitātes ietvaros tika veikti noslēguma eksperimenti, kuru būtība bija imūndetekcijas paneļu efektivitātes uzlabošana un validēšana, izmantojot lielāku celiakijas, latentā diabēta un veselo pacientu serumu skaitu. Šo eksperimentu ietvaros tika nelielās robežās variēts ar antigēnu mikrolodīšu un detekcijas antivielas daudzumiem imūnreakcijā, kā arī tika veikti aprēķini pieļaujamā signāla fona noteikšanai. Iegūtie rezultāti uzrādīja labu atkārtojamību starp eksperimentiem un mērījumiem, un zemu procentu ar nepatiesi pozitīviem/negatīviem rezultātiem.
No šiem eksperimentiem iegūtie rezultāti, kā arī visi iepriekš izveidotie metodiskie pieraksti tika apkopoti un tā rezultātā tika izstrādāts jaunas imūndetekcijas tehnoloģijas apraksts. Paralēli šeit aprakstītajiem visā atskaites perioda gaitā tika arī intensīvi strādāts pie starptautiski atzītas publikācijas manuskripta teksta un attēlu sagatavošanas.
Aktivitāte Nr.3. Pētniecības rezultātu rūpnieciskā īpašuma tiesību nostiprināšana
Šīs projekta aktivitātes ietvaros tika izveidots patenta zinātniskā pamatojuma teksts, sagatavotas intelektuālā īpašuma pretenzijas un tās skaidrojošie vizuālie elementi (tabulas, attēli, utt.).
Informācija sagatavota: 31.08.2015.