Efektīvu augļaugu atveseļošanas paņēmienu un jaunu patogēnu diagnostikas komponenšu izstrāde vīrusbrīva stādāmā materiāla iegūšanai
Projekts tiek īstenots ERAF 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvarosProjekta vienošanās Nr. 2010/0312/2DP/2.1.1.1.0/10/APIA/ VIAA/155Projekta iesniedzējs: APP Latvijas Valsts augļkopības institūtsSadarbības partneris: APP Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrsProjekta izpildes termiņš: 48 mēneši (01.01.2010.-31.12.2013.) Projekta kopējais finansējums: 336 000 LVL, projekta LBMC finansējuma daļa: 120 000 LVLProjekta zinātniskais vadītājs LBMC: Dr.biol. A. ZeltiņšProjekts tiek īstenots Latvijas Valsts augļkopības institūtā un Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrā.
Projekta vispārīgais mērķis ir izstrādāt efektīvus augļaugu atveseļošanas paņēmienus un jaunas patogēnu diagnostikas komponentes. Lai sasniegtu projekta vispārīgo mērķi, ir definēti sekojoši specifiskie mērķi:
1) Izstrādāti paņēmieni ābeļu un bumbieru somaklonālās mainības samazināšanai in vitro pavairošanas un atveseļošanas laikā un izveidota mikrosatelītu (SSR) marķieru kopa somaklonālās mainības agrīnai diagnostikai in-vitro materiālā;
2) Noskaidrotas sakarības starp Upeņu reversijas vīrusu (BRV) ģenētisko dažādību, tā pārnesē iesaistīto Cecidophyopsis pumpurērču sugu sastāvu un Ribes ģints augu rezistenci;
3) Izstrādāti efektīvi RBDV un ASGV eliminācijas un stādmateriāla atveseļošanas paņēmieni ābelēm, bumbierēm un avenēm;
4) Izstrādātas efektīvas un laboratorijas ikdienas praksē ērti pielietojamas ELISA testa pamatkomponentes BRV diagnostikai – specifiskas antivielas.
Sagaidāmie rezultāti
Projekta partnera – Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centra darba grupas galvenais uzdevums ir iegūt preparatīvos daudzumos BRV diagnostikas pamatkomponenti – poliklonālās antivielas un izstrādāt augu patoloģijas laboratoriju vajadzībām vienkārši izmantojamu testu.
Uz antivielām balstīta BRV diagnostikas testam nav komerciāla analoga pasaules tirgū. Augsti specifiskas antivielas ļauj izmantot analīzēm vienkārši sagatavotus augu paraugus (augu daļu ekstraktus bez papildus attīrīšanas) un īsā laika periodā pārbaudīt lielu paraugu apjomu. Specifiskas antivielas ar augstu titru ir komerciālu ELISA testu galvenā sastāvdaļa. Tradicionāli antivielas iegūst, imunizācijām izmantojot augu vīrusus, kas izolēti no inficētiem augiem. Tā kā BRV gadījumā vīrusu koncentrācija upenēs ir ļoti zema, tad imunizācijai piemērota materiāla iegūšana bez saimniekauga proteīnu piemaisījumiem var izrādīties neiespējama. Lai iegūtu specifiskas antivielas, izejas materiāla sagatavošanai imunizāciju vajadzībām tiek plānots izmantot rekombinantu proteīnu un vīrusiem līdzīgo daļiņu (VLP) laboratorijas tehnoloģijas, kādas līdz šim nav pielietotas BRV gadījumā. Projektā plānoto mākslīgo BRV struktūru iegūšanas un imunizāciju rezultātā tiks iegūtas ELISA testam nepieciešamās antivielas, lai laboratoriju praksē varētu realizēt augu patologiem labi pazīstamās uz antivielām balstītās augu vīrusu analīzes. Iegūtās antivielas tiks validētas, paralēli analizējot inficētu upeņu paraugus ar RT-PCR testu, lai demonstrētu antivielu specifiskumu. Šādu diagnostikas testa pamatkomponenšu – antivielu izstrāde nodrošinās pamatu jauna komerciāla produkta (ELISA testu) izveidošanai, kāds līdz šim tirgū BRV diagnostikai nav pieejams.
1.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti:
1.aktivitāte: Tehniski ekonomiskā pamatojuma izstrāde un projekta ieviešanas alternatīvu izvērtējums
1. Pārskata periodā izstrādāts tehniski ekonomiskais pamatojums un izvēlēta projekta ieviešanas efektīvākā alternatīva
2.aktivitāte: Ietekmējošo faktoru izpēte un analīze inovatīvu augļaugu atveseļošanas paņēmienu un patogēnu diagnostikas komponenšu izstrādei
1.Uzsākta jaunākās literatūras izpēte par:
1) Upeņu reversijas vīrusa (BRAV) molekulāro un strukturālo bioloģiju.
2. Uzsākta un veikta:
1) Upeņu reversijas vīrusa (BRV) molekulārās diagnostikas metodes RT-PCR adaptācija laboratorijas apstākļos;
2) metodes adaptācija upeņu kopējās RNS izolēšanai no inficētiem augiem, un salīdzināšana ar komerciāli pieejamajiem RNS izdalīšanas reaģentu komplektiem.
Informācija apkopota 14.03.2011.
2.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti
2.aktivitāte: Ietekmējošo faktoru izpēte un analīze inovatīvu augļaugu atveseļošanas paņēmienu un patogēnu diagnostikas komponenšu izstrādei
1.Turpināta/uzsākta jaunākās literatūras izpēte par:
1) Upeņu reversijas vīrusa (BRAV) molekulāro un strukturālo bioloģiju;
2. Turpināta/uzsākta:
1) Upeņu reversijas vīrusa (BRV) molekulārās diagnostikas metodes RT-PCR adaptācija laboratorijas apstākļos un uzsākta paraugu analīze;
2) BRV CP gēna pilnās kopijas klonēšanas eksperimenti baktēriju E.coli un raugu S.cerevisisae ekspresijas vektoros ar mērķi iegūt mākslīgus BRV virionus (VLP) no mikroorganismu šūnām.
Informācija apkopota 14.06.2011.
3.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti
2.aktivitāte: Ietekmējošo faktoru izpēte un analīze inovatīvu augļaugu atveseļošanas paņēmienu un patogēnu diagnostikas komponenšu izstrādei
Pārskata periodā:
1) Uzsākta BRV virionu attīrīšanas protokola izstrāde no inficēta augu materiāla;
2) Pārbaudīta iespēja iegūt BRV preparātus tieši no inficētām upenēm, bez laboratorija testaugu inficēšanas etapa;
3) Klonētas BRV virsmas proteīna gēna pilnās kopijas dažādos un uzsāktas ekspresijas sistēmu pārbaudes.
4.aktivitāte. Pētniecības rezultātu publiskas pieejamības nodrošināšana
1. Sagatavoti un iesniegti publicēšanai 3 zinātnisko rakstu manuskripti
Informācija apkopota 30.09.2011.
4.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti
2.aktivitāte: Ietekmējošo faktoru izpēte un analīze inovatīvu augļaugu atveseļošanas paņēmienu un patogēnu diagnostikas komponenšu izstrādei
Pārskata periodā:
1) veiktas dažādu ekspresijas vektoru pārbaudes dažādos E.coli un S.cerevisiae celmos.;
2) veikta kultivēšanas apstākļu pārbaude;
3) veikta BRV vīrusiem līdzīgo daļiņu (VLP) veidošanās noteikšana.
3.aktivitāte. Inovatīvu augļaugu atveseļošanas un patogēnu diagnostikas komponenšu ieguves paņēmienu eksperimentāla izstrāde.
Pārskata periodā uzsākta:
1) BRV līdzīgo daļiņu attīrīšanas protokola izstrāde;
2) Laboratorijas dzīvnieku imunizācijas eksperimenti.
4.aktivitāte. Pētniecības rezultātu publiskas pieejamības nodrošināšana
Sagatavoti un iesniegti publicēšanai zinātnisko rakstu manuskripti.
Informācija apkopota 14.02.2012.
5.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti
2.aktivitāte: Ietekmējošo faktoru izpēte un analīze inovatīvu augļaugu atveseļošanas paņēmienu un patogēnu diagnostikas komponenšu izstrādei
Pārskata periodā:
1) veiktas ekspresijas vektoru pārbaudes dažādos E.coli un S.cerevisiae celmos un kultivēšanas apstākļu optimizācija.
3.aktivitāte. Inovatīvu augļaugu atveseļošanas un patogēnu diagnostikas komponenšu ieguves paņēmienu eksperimentāla izstrāde.
Pārskata periodā turpināts/uzsākts darbs pie:
1) Laboratorijas dzīvnieku imunizācijas eksperimentiem;
2) BRV attīrīšanas protokola izstrādes.
Informācija apkopota 14.06.2012.
6.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti
2.aktivitāte: Ietekmējošo faktoru izpēte un analīze inovatīvu augļaugu atveseļošanas paņēmienu un patogēnu diagnostikas komponenšu izstrādei
Pārskata periodā:
1) Turpināti eksperimenti ar mērķi atrast optimālo ekspresijas sistēmu BRV VLP iegūšanai; 2) Pārbaudīta CP veidošanās bezšūnu sintēzes apstākļos un konstruēts vektors šim mērķim.
3.aktivitāte: Inovatīvu augļaugu atveseļošanas un patogēnu diagnostikas komponenšu ieguves paņēmienu eksperimentāla izstrāde.
3.3.Pārskata periodā turpināts darbs pie:
1) Laboratorijas dzīvnieku imunizācijas eksperimentiem;
2) BRV attīrīšanas protokola izstrādes.
Informācija apkopota 05.11.2012.
7.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti
2.aktivitāte: Ietekmējošo faktoru izpēte un analīze inovatīvu augļaugu atveseļošanas paņēmienu un patogēnu diagnostikas komponenšu izstrādei
Turpināts darbs pie eksperimentiem ar mērķi atrast optimālo ekspresijas sistēmu BRV VLP iegūšanai.
3.aktivitāte. Inovatīvu augļaugu atveseļošanas un patogēnu diagnostikas komponenšu ieguves paņēmienu eksperimentāla izstrāde.
Turpināts/ uzsākts darbs pie:
1) BRV attīrīšanas preperatīvos daudzumos;
2) Laboratorijas dzīvnieku imunizācijas eksperimentiem.
Informācija apkopota 28.02.2013.
8.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti
2.aktivitāte: Ietekmējošo faktoru izpēte un analīze inovatīvu augļaugu atveseļošanas paņēmienu un patogēnu diagnostikas komponenšu izstrādei
Turpināti eksperimenti ar mērķi atrast optimālo ekspresijas sistēmu BRV VLP iegūšanai.
3.aktivitāte: Inovatīvu augļaugu atveseļošanas un patogēnu diagnostikas komponenšu ieguves paņēmienu eksperimentāla izstrāde.
Turpināts/ uzsākts darbs pie:
1) Laboratorijas dzīvnieku imunizācijas eksperimentiem;
2) eksperimentu sērijas ar mērķi noskaidrot iegūto antivielu piemērotību inficētu upeņu lapu analīzēm.
5.aktivitāte. Rūpnieciskā īpašuma tiesību nostiprināšana.
Veikta patentu datu bāzu izpēte un informācijas atjaunošana, un veikta prasību izpēte patentu pieteikumu sagatavošanai.
Informācija apkopota 14.06.2013.
9.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti
3.aktivitāte. Inovatīvu augļaugu atveseļošanas un patogēnu diagnostikas komponenšu ieguves paņēmienu eksperimentāla izstrāde.
Turpināts darbs pie:
1) Eksperimentiem ar mērķi atrast efektīvu ekspresijas sistēmu BRV vīrusiem līdzīgo daļiņu iegūšanai, izmantojot alternatīvu ekspresijas sistēmu, kura ir balstīta uz raugu šūnām Pichia pastoris;
2) Iegūto antivielu pārbaudes imunoblotu eksperimentu apstākļos;
3) Eksperimentu sērijas ar mērķi noskaidrot iegūto antivielu piemērotību inficētu upeņu lapu ELISA un „immunocapture” RT-PCR analīzēm.
Informācija apkopota 14.10.2013.
10.pārskata periodā veiktās aktivitātes un sasniegtie rezultāti
3.aktivitāte: Inovatīvu augļaugu atveseļošanas un patogēnu diagnostikas komponenšu ieguves paņēmienu eksperimentāla izstrāde.
Paralēli analizējot upeņu paraugus ar RT-PCR, imunoblota, ELISA un IC-RT-PCR palīdzību tika konstatēts, ka visas minētās metodes neuzrādīja viennozīmīgus rezultātus. Veicot eksperimentus ar tradicionālo OneStep RT-PCR, tika atrasta metode, ar kuras palīdzību iespējams viennozīmīgi identificēt vīrusa klātbūtni ar BRV inficētu upeņu lapās.
4.aktivitāte: Pētniecības rezultātu publiskas pieejamības nodrošināšana
Publicēta 1 zinātniskās publikācija.
5.aktivitāte. Rūpnieciskā īpašuma tiesību nostiprināšana.
Sagatavoti un iesniegti LR Patentu valdē 1 patentu pieteikums.
Informācija apkopota 07.02.2014.