Prognostiska imūnterapijas lietderīguma un efektivitātes testēšana: metodes izveide personalizētai imūnterapeitisko preparātu pielietošanai onkoloģijā
Projekts tiek īstenots ERAF 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros Projekta vienošanās Nr. 2010/0233/2DP/2.1.1.1.0/10/APIA/VIAA/076
Projekta izpildes termiņš: 36 mēneši (01.10.2010.-31.09.2013.)
Projekta kopējais finansējums: 294938 LVL
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr. biol. Dace Pjanova
Projekta īstenošanas vieta ir APP Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs, BMC
Aktualitāte:
Imūnmodulējošo preparātu pielietošana klīnikā daudzos gadījumos ir empīriska un iznākums ir grūti paredzams. Imūnās atbildes paredzēšanai, kā arī monitorēšanai ir nepieciešams atrast tās imūnās šūnas un citokīnus, kas vislabāk atspoguļotu organisma atbildes reakciju uz pielietoto preparātu.
Projekta vispārīgais mērķis ir uzlabota onkoloģisko pacientu imūnterapijas efektivitāte.
Projekta specifiskais mērķis ir personalizētas prognostiskas in vitro testēšanas metodes izveide imūnterapetisko preparātu lietošanas lietderīguma paredzēšanai pirms terapijas uzsākšanas.
Lai nodrošinātu mērķu sasniegšanu, projekta ietvaros plānots īstenot šādas aktivitātes:
1. Pētniecība (rūpnieciskais pētījums):
1.1. preparātu ierosināto limfocītu sub-populāciju noteikšana,
1.2. preparātu ierosināto limfocītu aktivitātes noteikšana,
1.3. preparātu ierosināto limfocītu ekspansijas noteikšana atsevišķās sub-populācijās un to
aktivitātes noteikšana dažādās onkoloģisko pacientu grupās,
1.4. Personalizētas prognostiskas imūnterapeitisko preparātu efekta in vitro testēšanas
metodikas izstrāde.
2. Pētniecības rezultātu publiskas pieejamības nodrošināšana
Projekta rezultātā tiks izstrādāta personalizēta prognostiska imūnterapeitisko preparātu lietošanas lietderīguma un efektivitātes in vitro testēšanas metodika ar pielietojumu klīnikā onkoloģisko pacientu imūnterapijas prognozējamības paaugstināšanai un imūnterapijas efektivitātes palielināšanai, piemeklējot katram pacientam piemērotāko preparātu un devu. Projekta rezultātā tiks izstrādāts metodes detalizēts aprakts.
Atskaites:
Līdz 2011. gada augustam:
Aktivitāte Nr.1. Pētniecība (rūpnieciskais pētījums)
Apakšaktivitāte Nr. 1.1. Preparātu ierosināto limfocītu sub-populāciju noteikšana
Trešajā atskaites periodā aktivitātes ietvaros:
1. Veikta imūnmodulatoru citopātiskas devas noteikšana normālo fibroblastu šūnu kultūrā HS-68 (tā kā Larifāns limfocītu šūnu kultūrās nebija citopātisks pat lielās koncentrācijas (skat. pārskatu Nr.2), tika nolemts tā citopātisko devu noteikt citas izcelsmes normālās šūnās, konkrēti fibroblastos). Arī šūnu kultūrā HS-68 Larifāns nav citopātiks lielās koncentrācijās un rezultāti korelēja ar rezultātiem, kas iegūti limfocītu šūnu kultūrās,
2. Izveidota imūnhistoķīmijas metodika virsmas marķieru analīzei, kas ļauj vienlaicīgi iekrāsot vairākus marķierus,
3. Izveidots makross automātiskai attēlu salikšanai no vairākām bildēm.
Apakšaktivitāte Nr. 1.2. Preparātu ierosināto limfocītu aktivitātes noteikšana
Trešajā atskaites periodā aktivitātes ietvaros:
1. tā kā Larifāns neizraisa citopātisko efektu pat lielās koncentrācijās, tad optimālās koncentrācijas noteikšanai izvēlēts ELISA tests, kurā noteiksim to Larifāna koncentrāciju, kas izsauc vislielāko IFN-γ veidošanas (ir zināms, ka Larifānam jāinducē IFN–γ sintēze).
Apakšaktivitāte Nr. 1.3. Preparātu ierosināto limfocītu ekspansijas noteikšana atsevišķās sub-populācijās un to aktivitātes noteikšana dažādās onkoloģisko pacientu grupās
Trešajā atskaites periodā aktivitātes ietvaros:
1. turpināta arhīva materiāla un anketu apkopošana par slimības gaitu un fenotipu, kā modeli izmantojot ādas ļaundabīgo melanomu, ar mērķi atlasīt tos parametrus, kas attiecīgi būtu saistāmi ar labvēlīgāku vai mazāk labvēlīgu iznākumu, lai testētu imūnpreparātu iedarbību atlasītajās grupās. Lai varētu veikt automātisko filtrēšanu, uzsāktu datu homogenizēšana.
Līdz 2011. gada 31. decembrim:
Aktivitāte Nr.1. Pētniecība (rūpnieciskais pētījums)
Apakšaktivitāte Nr. 1.1. Preparātu ierosināto limfocītu sub-populāciju noteikšana
Ceturtajā atskaites periodā aktivitātes ietvaros: 1. izveidota un uz kultivētiem limfocītiem aprobēta virsmas marķieru (CD3, CD16, CD56, CD19, CD95, HLA-DR, CD4, CD25, CD152, Foxp3, CD8, CD28, CD38 un CD119) noteikšanas metodika plūsmas citometrijā; 2. izveidota un uz kultivētiem limfocītiem aprobēta intracelulāro marķieru (IFN-γ, granzīma B, perforīna) noteikšanas metodika plūsmas citometrijā; 3. novērots procentuāls CD8+ (citotoksisko T limfocītu) pieaugums pēc limfocītu kultivēšanas Larifāna klātbūtnē.
Apakšaktivitāte Nr. 1.2. Preparātu ierosināto limfocītu aktivitātes noteikšana
Ceturtajā atskaites periodā aktivitātes ietvaros: 1. savāktas un iesaldētas barotnes no īslaicīgajām limfocītu šūnu kultūrām limfocītu aktivitātes noteikšanai. 2. izveidota metodika limfocītu aktivitātes, to sekretēto citokīnu noteikšanai.
Apakšaktivitāte Nr. 1.3. Preparātu ierosināto limfocītu ekspansijas noteikšana atsevišķās sub-populācijās un to aktivitātes noteikšana dažādās onkoloģisko pacientu grupās
Ceturtajā atskaites periodā aktivitātes ietvaros: 1. turpināta arhīva materiāla un anketu apkopošana.
Līdz 2012. gada aprīlim:
Apakšaktivitāte Nr. 1.1. Preparātu ierosināto limfocītu sub-populāciju noteikšana
1. Veikta limfocītu virsmas marķieru (CD3, CD16, CD56, CD19, CD95, HLA-DR, CD4, CD25, CD152, Foxp3, CD8, CD28, CD38 un CD119) analīze kontroles personās. Notiek iegūto datu apstrāde un analīze.
2. Veikta intracelulāro marķieru (IFN-γ, granzīma B, perforīna) analīze kontroles personās. Notiek iegūto datu apstrāde un analīze.
Apakšaktivitāte Nr. 1.2. Preparātu ierosināto limfocītu aktivitātes noteikšana
1. izanalizētas savāktās barotnes no īslaicīgajām limfocītu kultūrām pēc to apstrādes ar Larifānu vai citiem imūnmodulatoriem; noteiktas 30 dažādu citokīnu izmaiņas gan atkarībā no imūnmodulara devas, gan inkubācijas laika imūnmodulatora klārbūtnē. Notiek iegūto datu apstrāde un analīze.
Apakšaktivitāte Nr. 1.3. Preparātu ierosināto limfocītu ekspansijas noteikšana atsevišķās sub-populācijās un to aktivitātes noteikšana dažādās onkoloģisko pacientu grupās
1. iesniegta publikācija par dažādu ādas ļaundabīgās melanomas parametru saistību ar slimības prognozi par pamatu ņemot pacientu dzīvildzi žurnālam Journal of European Association of Dermatology and Venereology (JEADV-2012-0565).
2. turpināta klīnisko parametru apstrāde un analīze saitībā ar audzēju metastazēšanos.
Apakšaktivitāte Nr. 1.4. Personalizētas prognostiskas imūnterapeitisko preparātu efekta in vitro testēšanas metodikas izstrāde
1. Izveidota datu bāzē eksperimentālo datu ievadīšanai.
Līdz 2012. gada 31. augustam:
Apakšaktivitāte Nr. 1.1. Preparātu ierosināto limfocītu sub-populāciju noteikšana
1. Izanalizēti atsevišķi limfocītu virsmas marķieri (CD3, CD16, CD56, CD19, CD95, HLA-DR, CD4, CD25, CD152, Foxp3, CD8, CD28, CD38 un CD119) un dažādas to kombinācijas kontroles personām.
2. Salīdzinātas minēto limfocītu virsmas marķieru izmaiņas dažādās kontroles personās ņemot vērā asinsainu limfocītu paņmešanas brīdī.
3. Konstatēts, ka limfocītu virsmas marķieru izmaiņas ir atkarīgas t.sk. arī no personas asinsainas.
Apakšaktivitāte Nr. 1.2. Preparātu ierosināto limfocītu aktivitātes noteikšana
1. Ar Luminex xMAP tehnoloģiju izanalizētas izmaiņas limfocītu sekretētajos citokīnos pēc to apstrādes ar Larifānu.
2.No 30 analizētajiem citokīniem 20 citokīnu gadījumā novēroja to koncentrācijas pieaugumu pēc Larifāna. Koncentrācijas pieaugums variēja atkarībā no katra analizētā citokīna. Ievērojams citokīnu koncentrācija pieaugums bija novērojams 10 citokīnu gadījumā.
3. Divu citokīnu (IP-10 un IL-16) gadījumā to koncentrācija pēc limfocītu apstrādes ar Larifānu kritās.
4. Astoņu citokīnu gadījumā to koncentrācija pēc limfocītu apstrādes ar Larifānu nemainījās.
5. Katrs citokīns savu maksimimu sasniedza atšķirīgā laikā pēc kontakta ar Larifānu.
Apakšaktivitāte Nr. 1.3. Preparātu ierosināto limfocītu ekspansijas noteikšana atsevišķās sub-populācijās un to aktivitātes noteikšana dažādās onkoloģisko pacientu grupās
Turpināta klīnisko parametru apstrāde un analīze saistībā ar audzēju metastazēšanos.
Apakšaktivitāte Nr. 1.4. Personalizētas prognostiskas preparātu efekta in vitro testēšanas metodikas izstrāde
Izveidotajā datu bāzē turpināti ievadīt eksperimentāli iegūtie dati.
Līdz 2012. gada 31. decembrim:
Apakšaktivitāte Nr. 1.1. Preparātu ierosināto limfocītu sub-populāciju noteikšana:
Aktivitāte noslēgusies. Galvenie rezultāti.
Izmantojot plūsmas citometriju ar 11 atsevišķiem limfocītu virsmas marķieriem noteiktas izmaiņas dažādās limfocītu subpopulācijās kontroles personām pēc šūnu ex vivo apstrādes ar Larifānu. Larifāna ietekmē pieaug aktivācijas marķieru CD95 un HLA-DR ekspresija uz B (CD45+CD19+) un T (CD45+CD3+) limfocītiem, kā arī dabīgajām galētājšūnām jeb NK (natural killer) šūnām. Ievērojams ir aktivācijas marķiera CD25 ekspresijas pieaugums uz CD3+CD4+ T līdzētājšūnām (T helper cells) un NK šūnām. Uz citotoksiskajiem T limfocītiem CD3+CD8+ novērots aktivācijas marķiera CD38 ekspresijas pieaugums. Ar Larifānu apstrādātajās kultūrās novērots arī šūnu skaita pieaugums T limfocītu subpopulācijā CD8+CD28-, kas ir šūnas ar regulatorām šūnām līdzīgām imūnsupresējošām īpašībām. Larifāna ietekmē novērots IFN-γ receptora (marķieris CD119) ekspresijas pieaugums uz T limfocītiem un NK šūnām. Secināts, ka Larifāna ietekmē notiek visu testēto imūnšūnu grupu (T un B limfocītu un NK šūnu) aktivitātes palielināšanās, bet izmaiņas dažādo limfocītu virsmas marķieru ekspresijā Larifāna ietekmē ir individuālas un saistītas ar imūnā stāvokļa atšķirībām asins paraugu ņemšanas brīdī.
Apakšaktivitāte Nr. 1.2. Preparātu ierosināto limfocītu aktivitātes noteikšana:
Aktivitāte noslēgusies. Galvenie rezultāti.
Izmantojot Luminex 200™ tehnoloģiju tika izanalizēti Larifāna un vēl divu labi zināmu limfocītu stimulatoru – lipopolisaharīda (LPS) un fitohemoaglutinīna (PHA), inducētie citokīni limfocītos pēc to izdalīšanas no perifērajām asinīm. Pēc rezultātu galīgās apstrādes noskaidrots, ka Larifāns no 29 dažādiem citokīniem inducēja 19, un vismaz deviņu citokīnu (IL-6, I-309, TNF-α, MIP-1β, IL-10, IFN-γ, TARC, GM-CS, IL-23) pieaugums bija ievērojams. LPS un PHA no 29 analizētajiem citokīniem attiecīgi inducēja 18 (10 pieaugums ievērojams) un 24 (20 pieaugums ievērojams) dažādus citokīnus. Salīdzinot Larifāna un LPS inducētos citokīnus konstatēts, ka inducēto citokīnu spektrs abiem induktoriem ir līdzīgs, vienīgi Larifāna gadījumā ietekme uz tādu citokīnu indukciju kā TNF-β, IFN-α2, MCP-4 un IL-4 bija lielāka. Savukārt, salīdzinot Larifāna un PHA inducētos citokīnus konstatēts, ka minēto stimulatoru inducēto citokīnu spektrs ir atšķirīgs. Ja PHA gadījumā citokīni IP-10 un IL-2 tika stimulēti, tad Larifāna gadījumā tie tika nomākti. Secināts, ka Larifāns ir plejotrops citokīnu induktors ar raksturīgu plašu inducēto citokīnu spektu.
Apakšaktivitāte Nr. 1.3. Preparātu ierosināto limfocītu ekspansijas noteikšana atsevišķās sub-populācijās un to aktivitātes noteikšana dažādās onkoloģisko pacientu grupās:
- Turpināta klīnisko parametru apstrāde un analīze saistībā ar audzēju metastazēšanos.
- Tiek ievākts un analizēts klīniskais materiāls (perifēro asiņu paraugi) no onkoloģiskajiem pacientiem.
- Iznākusi publikācija raksts par dažādu ādas ļaundabīgās melanomas parametru saistību ar slimības prognozi par pamatu ņemot pacientu dzīvildzi: Azarjana K, Ozola A, Ruklisa D, Cema I, Rivosh A, Azaryan A, and Pjanova D. Melanoma epidemiology, prognosis and trends in Latvia. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2012 Oct 27. doi: 10.1111/jdv.12007. [Epub ahead of print].
Apakšaktivitāte Nr. 1.4. Personalizētas prognostiskas imūnterapeitisko preparātu efekta in vitro testēšanas metodikas izstrāde:
Izveidotajā datu bāzē turpināti ievadīt eksperimentāli iegūtie dati.
Līdz 30. aprīlim 2013. gads:
Apakšaktivitāte Nr. 1.1. Preparātu ierosināto limfocītu sub-populāciju noteikšana
Aktivitāte noslēgusies.
Apakšaktivitāte Nr. 1.2. Preparātu ierosināto limfocītu aktivitātes noteikšana
Aktivitāte noslēgusies.
Publikācijai iesniegts raksts: Rūta Veinalde, Ramona Petrovska, Rūta Brūvere, Guna Feldmane, and Dace Pjanova.. Ex vivo cytokine production in peripheral blood mononuclear cells after their stimulation with dsRNA. (raksts pievienots atskaitei)
Apakšaktivitāte Nr. 1.3. Preparātu ierosināto limfocītu ekspansijas noteikšana atsevišķās subpopulācijās un to aktivitātes noteikšana dažādās onkoloģisko pacientu grupās.
1. Turpināta klīnisko parametru apstrāde un analīze saistībā ar audzēju metastazēšanos.
2. Turpinās klīniskā materiāla ievakšana (perifēro asiņu paraugi) no onkoloģiskajiem pacientiem.
Secinājumi:
1) Larifāns audzēju šūnām nav toksisks,
2) Larifāns kavē audzēju augšanu nomācot šūnu proliferatīvo aktivitāti.
3) Larifāna antiproliferatīvā iedarbība ir ne tikai tieša, bet arī pastarpināta, proti, saistīta ar Larifāna spēju aktivizēt citokīnu produkciju un izdali no perifēro asiņu limfocitārajām šūnām.
4) Larifāns koncentrācijā ir 200 μg/ml aktivē limfocītos 14 citokīnu produkcijai. 12 no pētījumā testētiem citokīniem netiek ietekmēti, savukārt trīs citokīnu produkcija tiek nomākta. Seši no inducētajiem citokīniem – MIP-1β, IL-10, TNF-α, IL-6, IFN-α un IFN-γ. MIP-1β, IL-10, TNF-α un IL-6 tika izvēlēti tālākai analīzei, jo ir visaugstākā koncentrācijā inducētie citokīni.
Visaugstākā koncentrācijā – 9312,165 pg/ml – tiek inducēts MIP-1 β un intensīvākā MIP-1β produkcija norisinās pirmo 48h laikā.. Veselam indivīdam MIP-1β koncentrācija ir 1-41 pg/ml (Breemen et al., 2007). Gadiem ilgi Larifāns ir uzskatīts galvenokārt par IFN induktoru. Īpaši nozīmīgs ir pētījumā ir noskaidrotais fakts, ka Larifāns spēj inducēt makrofāgu iekaisuma proteīnu 1β (MIP-1β).
MIP-1β ir nozīmīgs HIV-1 supresējošs faktors. Tas spēj nomākt HIV replikāciju un iekļuvi makrofāgos (Saunders et al., 2011; Zhou et al., 2010), tātad arī tālāku izplatību uz CD4+ T limfocītiem. Iepriekš veiktajos pētījumos vēl nebija noskaidrots, ka Larifāns spēj producēt MIP-1β. Šis atklājums medikamentam rada jaunas pētījumu un pielietojuma perspektīvas, it īpaši HIV infekcijas sakarā.
Apakšaktivitāte Nr. 1.4. Personalizētas prognostiskas imūnterapeitisko preparātu efekta in vitro testēšanas metodikas izstrāde
Astotājā atskaites periodā izveidotajā datu bāzē turpināta eksperimentāli iegūto datu ievadīšana.
Publicēts raksts: Olita Heisele. Imūnsistēma un tās palīgi. TERRA.LU. 14.02.2013 http://www.lu.lv/terra2/raksti/t/18468/ (raksts pievienots atskaitei)
Līdz 30. septembrim 2013. gads:
Projekta mērķis bija izveidot metodiku personalizētai prognostiskai in vitro testēšanas metodei imūnterapetisko preparātu lietošanas lietderīguma paredzēšanai pirms terapijas uzsākšanas, kas sekmīgi arī sasniegts (izstrādātā metodika pievienota gala atskaitei).
Papildus metodikai projekta gaitā bija paredzēts uzrakstīt un iesniegt divus zinātniskus rakstus, kas arī sekmīgi ir realizēts. Projekta gaitā radušies sekojoši raksti, kas jau ir publiski pieejami:
- Azarjana K, Ozola A, Ruklisa D, Cema I, Rivosh A, Azaryan A, Pjanova D. Melanoma epidemiology, prognosis and trends in Latvia. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2012 Oct 27. doi: 10.1111/jdv.12007. [Epub ahead of print] PMID: 23106225 [PubMed – as supplied by publisher], http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23106225
- Ozola A, Azarjana K, Doniņa S, Proboka G, Mandrika I, Petrovska R, Cēma I, Heisele O, Eņģele L, Streinerte B, Pjanova D. Melanoma risk associated with MC1R gene variants in Latvia and the functional analysis of rare variants. Cancer Genet. 2013 Mar;206(3):81-91. doi: 10.1016/j.cancergen.2013.01.002. Epub 2013 Mar 20. PMID: 23522749 [PubMed – in process], http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23522749
- Veinalde R, Petrovska R, Brūvere R, Feldmane G, Pjanova D. Ex vivo cytokine production in peripheral blood mononuclear cells after their stimulation with dsRNA of natural origin. Biotechnol Appl Biochem. 2013 Aug 13. doi: 10.1002/bab.1143. [Epub ahead of print] PMID: 23941496, [PubMed – as supplied by publisher], http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23941496
Tāpat bija paredzēts uzrakstīt divus populārzinātniskus rakstus, kas arī sekmīgi paveikts. Divi populārzinātniski raksti ir publicēti populārzinātniskā žurnālā TERRA2.0, kas pieejams elektroniskā vidē:
- Heisele Olita, Imūnsistēma un tās palīgi, TERRA2.0, 14.02.2013. http://www.lu.lv/terra2/raksti/t/18468/
- Veinalde Rūta, Veselīga imūnsistēmas mānīšana, TERRA2.0, 24.09.2013. http://www.lu.lv/terra2/raksti/t/22730/
Projekta izpildes gaitā atklājās vairāki zinātniskās novitātes fakti attiecībā uz preparāta Larifāna pretaudzēju un pretvīrusu darbības mehānismiem un darbības aspektiem, kuri ir publicēti augšminētajos rakstos.
Ievērojamākie no tiem ir sekojošie.
1) Gadiem ilgi Larifāns ir uzskatīts par IFN induktoru. Projekta pētījumu rezultātā noskaidrojās, ka Larifāns spēj inducēt ne tikai interferonus, bet arī hemokīna – makrofāgu iekaisuma proteīna 1β (MIP-1β), kurš literatūrā ir pazīstams kā spēcīgs vīrusu infekciju nomācējs faktors. Spriežot pēc rezultātiem intensīvākā MIP-1β produkcija norisinās pirmo 48h laikā pēc kontakta ar Larifānu un tā koncentrācija ir negaidīti liela. Ir zināms, ka MIP-1β ir svarīgs HIV-1(AIDS izraisītājs) nomācošs faktors. Tas spēj inhibēt HIV vairošanos un iekļuvi makrofāgos (Saunders et al., 2011; Zhou et al., 2010), tātad arī tālāku izplatību uz CD4+ T limfocītiem, kurus tas nogalina. Iepriekš veiktajos pētījumos vēl nebija noskaidrots, ka Larifāns spēj producēt MIP-1β. Šis atklājums medikamentam rada jaunas pētījumu un pielietojuma perspektīvas, it īpaši HIV infekcijas sakarā, jo mūsdienās intensīvi tiek meklēti preparāti, kas būtu spējīgi rosināt šī citokīna paaugstinātu sintēzi.
2) Pierādījās izteikta Larifņa antiproliferatīva darbība attiecībā uz vairāku audzēju šūnām. Nozīmīgākais šajā darba daļā ir atradums, ka Larifāns kavē ļaundabīgo B imūnšūnu audzēja, ļaundabīgās mielomas šūnu vairošanos (mitotisko aktivitāti) un augšanu. Īpašais nozīmīgums saistīts ar to, ka, šim audzējam nav zināmas kādas tradicionāli efektīgas terapijas metodes. Iegūtais faktu materiāls liecina, ka tālāki pētījumi par Larifānu kā mielomas ārstēšanas līdzekli varētu būt perspektīvi.