Uz autoantivielu noteikšanu balstītu ļaundabīgo audzēju diagnostikas un prognostikas testu izstrāde

Projekts tiek īstenots ERAF 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros.
Projekta identifikācijas Nr. 2010/0231/2DP/2.1.1.1.0/10/APIA/VIAA/044
Projekts tiek īstenots 36 mēnešu laikā, sākot no 2011. gada 3. janvāra.
Projekta kopējais finansējums: 367 428 LVL
Projekta zinātniskā vadītāja: Dr. biol. Aija Linē

Projekta vispārīgais mērķis ir, izmantojot modernas molekulārās bioloģijas metodes, izstrādāt un validēt principiāli jaunu ļaundabīgo audzēju diagnostikas un/vai prognostikas testu, kas dod iespēju atklāt audzējus agrīnā stadijā un prognozēt slimības gaitu, tādējādi sekmējot zinātnes un ražošanas integrāciju un dodot ieguldījumu sabiedrības veselības aprūpes uzlabošanā un tautsaimniecības attīstībā.

Projekta specifiskais mērķis ir identificēt autoantivielu biomarķieru paneļus, kas ir izmantojami kuņģa un prostatas vēža diagnostiskā un/vai prognostikā, uz to bāzes izstrādāt multipleksu seroloģisko testu prototipus un tos testēt, lai noskaidrotu to tehniskos un diagnostiskos rādītājus (technical and diagnostic performance).

Projekts atbilst ar saimniecisku darbību nesaistīta projekta kritērijiem, jo projektu īsteno zinātniska institūcija, kas atbilst MK noteikumu Nr. 752 3.1.1. apakšpunktā sniegtajai definīcijai, intelektuālā īpašuma tiesības, kas izriet no tās pamatdarbības, tiek nodotas publiskā valdījumā un tiks nodrošināta projekta rezultātu publiska pieejamība.

Lai nodrošinātu projekta mērķu sasniegšanu, paredzēts īstenot šādas aktivitātes:

1. Pētniecība:

1.1.  Rūpnieciskais pētījums – izpētes darbs, kura mērķis ir identificēt unikālu audzēju antigēnu kombināciju, ar kuras palīdzību iespējams noteikt autoantivielu kā diagnostisku/prognostisku biomarķieru klātbūtni serumā, un novērtēt to diagnostisko nozīmi, un ietver sekojošus uzdevumus:

1.1.1. Seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas izveidošana;

1.1.2. Kuņģa vēža diagnostikas biomarķieru paneļa izveidošana;

1.1.3. Prostatas vēža diagnostikas un/vai prognostikas biomarķieru paneļa izveidošana.

1.2. Eksperimentālā izstrāde, kuras mērķis ir noskaidrot piemērotāko tehnoloģisko risinājumu klīnikā pielietojamu vēža diagnostikas un/vai prognostikas testu izstrādei,  izgatavot testu prototipus un tos testēt, un ietver sekojošus uzdevumus:

1.2.1. Rekombinanto proteīnu mikročipu un Luminex xMAP mikrosfēru tehnoloģiju piemērotības izvērtēšana multipleksa seroloģiska testa izstrādei;

1.2.2. Multipleksu seroloģisko testu prototipu izstrāde un testēšana.

2. Pētniecības rezultātu publiskas pieejamības nodrošināšana.

3. Pētniecības rezultātu rūpnieciskā īpašuma tiesību nostiprināšana.

Atskaites:

Līdz 2011. gada jūlijam:

• Iesākts darbs pie kuņģa un prostatas vēža pacientu seruma paraugu biobankas un klīniskās informācijas datubāzes veidošanas – ir izstrādāta klīniskās informācijas anketa un sistēma paraugu vākšanai, pacientu iekļaušanas un izslēgšanas kritēriji, un pētījumā iesaistīti vairāk kā 100 pacienti.
• Analizējot iepriekš iegūtos autoantivielu profilus, kā arī fāga displeja vektoros klonējot zināmus audzēju antigēnus (BIRC5, MAGEA3, TYR, SPAG u.c.), izveidots 169 kuņģa vēža antigēnu panelis un tas sagatavots rekombinanto fāgu mikročipu izgatavošanai (rekombinanto fāgu panelis ir amplificēts, veiktas PCR-balstītas kvalitātes kontroles tā tīrības novērtēšanai un alikvotēts replikācijas platēs).
• Optimizēta metodika rekombinanto fāgu mikročipu printēšanai un izgatavoti mikročipi 600 seruma paraugu testēšanai;
• Izstrādāts tehniskais protokols rekombinanto proteīnu mikročipu un Luminex xMAP mikrosfēru tehnoloģiju salīdzināšanai.

Līdz 2011. gada septembrim:

• Tika turpināts darbs pie seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas veidošanas.
• Izgatavota fokusēta kuņģa vēža antigēnu mikročipa versija un tā testēta ar 289 kuņģa vēža pacientu, 233 veselu cilvēku, 52 kuņģa čūlas un 98 gastrīta pacientu seruma paraugiem. Izmantojot oriģinālu, speciāli šim nolūkam izstrādātu datu apstrādes un rezultātu analīzes metodiku, identificēts 45 antigēnu panelis, ko paredzēts izmantot kuņģa vēža specifisko autoantivielu detektēšanai cilvēka serumā.
• Autoantivielu testa rezultāti parādīja, ka kuņģa vēža un praktiski veselu cilvēku serumus tas spēj atšķirt ar 58% jutību un 91% specifiskumu (74.5% precizitāti), kuņģa vēzi un kuņģa čūlu – ar 73% precizitāti, kuņģa vēzi un gastrītu – ar 63.5% precizitāti. Būtiski, ka autoantivielu tests vienlīdz labi spēj detektēt agrīnas un vēlīnas stadijas audzējus, kā arī dažādu histoloģisko tipu audzējus.
• Tiek turpināts darbs pie rekombinanto proteīnu mikročipu un Luminex xMAP mikrosfēru tehnoloģiju salīdzināšanas, lai izvēlētos piemērotāko tehnoloģisko platformu diagnostikas testa izstrādāšanai.

Līdz 2011. gada decembrm:

• Tiek turpināts darbs pie kuņģa un prostatas vēža pacientu seruma un audu paraugu biobankas un klīniskās informācijas datubāzes veidošanas.
• Pabeigta autoantivielu profilu analīze kuņģa vēža un iekaisuma slimību pacientu un praktiski veselu cilvēku serumā – ir izveidots 45 biomarķieru modelis kuņģa vēža diagnostikai un noteikti tā diagnostiskie/statistiskie rādītāji.
• Tiek gatavots ES patenta pieteikumus un publikācija par autoantivielu profilu izmantošanu kuņģa vēža diagnostikā.
• Iesākts darbs pie prostatas vēža antigēnu atlases fokusētas mikročipa versijas izgatavošanai – tiek analizēti iepriekšējos pētījumos iegūtie autoantivielu profilēšanas dati kā arī jaunākā zinātniskā literatūra par autoantivielu sastopamību prostatas vēža pacientu serumā; iesākts darbs pie rekombinanto fāgu kvalitātes kontroles.
• Tiek turpināts darbs pie rekombinanto proteīnu iegūšanas un attīrīšanas, mikročipu un Luminex xMAP mikrosfēru tehnoloģiju salīdzināšanai.
• Iznākusi publikācija par antigēnu mikročipu datu apstrādes metodiku: Jumutc V, Zayakin P, Borisov A. Ranking-based kernels in applied biomedical diagnostics using a support vector machine. Int J Neural Syst. 2011 Dec;21(6):459-73.

Līdz 2012. gada martam:

• Tiek turpināts darbs pie seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas veidošanas; datu bāze tika papildināta ar kuņģa vēža pacientu dzīvildzes datiem, kas nepieciešami, lai noskaidrotu atrasto biomarķieru prognostisko vērtību.
• Ir iesākts darbs pie kuņģa vēža autoantivielu testa un pepsinogēnu testa rezultātu korelācijas analīzes, lai novērtētu iespējas šos testus kombinēt;
• Ir iesākts darbs pie kuņģa vēža biomarķieru paneļa prognostiskās vērtības noskaidrošanas;
• Tiek turpināts darbs pie prostatas vēža diagnostikas un prognostiskas biomarķieru paneļa veidošanas;
• Tiek turpināts darbs pie rekombinanto proteīnu iegūšanas, lai izvērtētu mikročipu un Luminex xMAP mikrosfēru tehnoloģiju piemērotību multipleksa seroloģiska testa izstrādei;
• Ir sagatavota un iesniegta publikācija par autoantivielu izmantošanu kuņģa vēža diagnostikā.
• Ir sagatavots un iesniegts Eiropas patenta pieteikums par biomarķieru paneli, ko var izmantot kuņģa vēža diagnostikā: Linē A, Siliņa K, Kalniņa Z. Zajakin P. European patent application No. EP12152404 GASTRIC CANCER BIOMARKERS AND METHODS OF USE THEREOF.

Līdz 2012. gada jūnijam:

• Tika turpināts darbs pie seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas veidošanas;
• Tika turpināts darbs pie kuņģa vēža autoantivielu testa un pepsinogēnu testa rezultātu korelācijas analīzes, lai novērtētu iespējas šos testus kombinēt;
• Iesākta seruma autoantivielu repertuāra analīze (skrīnējot kDNS ekspresijas bibliotēkas) tiem kuņģa vēža pacientiem, kuriem autoantivielu tests bija negatīvs, lai noskaidrotu vai šajos gadījumos autoantivielas veidojas pret antigēniem, kas nav pārstāvēti mūsu izgatavotajā testā vai arī šiem pacientiem autoantivielas pret vēža šūnu antigēniem neveidojas;
• Tika turpināts darbs pie prostatas vēža diagnostikas un prognostiskas biomarķieru paneļa veidošanas;
• Iegūti 6 rekombinantie proteīni un tie izmantoti, lai salīdzinātu dažāda pārklājuma mikročipu slaidus un tehnoloģiskos risinājumus proteīnu mikročipu izgatavošanai; tiek plānota analoga eksperimentu sērija, lai novērtētu Luminex xMAP mikrosfēru tehnoloģijas piemērotību multipleksa seroloģiska testa izstrādei;
• Iznākusi publikācija par autoantivielu izmantošanu kuņģa vēža diagnostikā: Zayakin P, Ancāns G, Siliņa K, Meistere I, Kalniņa Z, Andrejeva D, Endzeliņš E, Ivanova L, Pismennaja A, Ruskule A, Doniņa S, Wex T, Malfertheiner P, Leja M, Linē A. Tumour-associated autoantibody signature for the early detection of gastric cancer. Int J Cancer.2012 Jun 9. doi: 10.1002/ijc.27667. [Epub ahead of print]

Līdz 2012. gada septembrim:

• Tika turpināts darbs pie seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas veidošanas;
• Iepriekšējā darba periodā tika izveidots 45-antigēnu panelis kuņģa vēža diagnostikai un tika noteikti tā diagnostiskie rādītāji, kas parādīja, ka šī testa specifiskums ir augsts, taču jutība ir nepietiekoša, lai to izmantotu kā neatkarīgu testu. Pašlaik galvenā uzmanība tiek vērsta uz to, lai noskaidrotu vai tiem kuņģa vēža pacientiem, kam testa rezultāts bija negatīvs, serumā vispār nav atrodamas antivielas pret vēža šūnu antigēniem, vai arī tās veidojas pret tādiem antigēniem, kas nav pārstāvēti mūsu testā. Tādēļ pašlaik tiek turpināts darbs pie autoantivielu repertuāra analīzes šo pacientu serumā, skrīnējot fāgu displeja bibliotēkas. Tas vai nu dos iespēju paaugstināt testa jutību, tajā pievienot šos antigēnus, vai arī dos atbildi par to, kāds ir teorētiski iespējamais jutības limits.
• Tiek turpināts darbs pie testa tehnoloģiskā risinājuma izstrādes. Iegūtie rezultāti parādīja, ka iepriekš izvēlētā HaloTag-HaloLink sistēma nedod iespēju pietiekami efektīvi attīrīt rekombinantos proteīnus tiešā veidā uz slaida virsmas, tādēļ pašlaik tiek meklēti citi risinājumi rekombinanto proteīnu attīrīšanai pirms printēšanas uz mikročipu slaidiem.

Līdz 2012. gada decembrim:

 Tika turpināts darbs pie seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas veidošanas.

• Tika iesākts darbs pie Audzēju Antigēnu datubāzes pilnveidošanas un restrukturēšanas.
• Tika turpināts darbs pie kDNS ekspresijas bibliotēku skrīnēšanas ar to kuņģa vēža pacientu serumiem, kam autoantivielu tests bija negatīvs, lai noskaidrotu vai šajos gadījumos autoantivielas veidojas pret antigēniem, kas nav pārstāvēti mūsu izgatavotajā testā vai arī šiem pacientiem autoantivielas pret vēža šūnu antigēniem neveidojas. Tārezultātā atrasti ~90 jauni antigēni un pašlaik tiek testēta to reaktivitāte ar kuņģa vēža pacientu un veselu cilvēku serumiem. Labākie no šiem antigēniem tiks pievienoti iepriekš izveidotajam kuņģa vēža antigēnu panelim.
• Tika izveidots prostatas vēža diagnostikas un prognostiskas biomarķieru panelis un iesākts darbs pie fokusētāprostatas vēža antigēnu mikročipa izgatavošanas.
• Ir iegūta virkne dažādu rekombinanto proteīnu, kas satur HaloTag, StrepTag un HisTag iezīmes. Iegūtie proteīni tiek izmantoti, lai salīdzinātu antigēnu mikročipu un Luminex xMAP mikrosfēru tehnoloģiju piemērotību multipleksa seroloģiska testa izstrādei.

Līdz 2013. gada martam:

• Tika turpināts darbs pie seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas veidošanas.
• Tika turpināts darbs pie Audzēju Antigēnu datubāzes pilnveidošanas un restrukturēšanas.
• Tika turpināts darbs pie prostatas vēža diagnostikas un prognostiskas biomarķieru paneļa veidošanas – ir izveidots prostatas vēža antigēnu panelis, kas ietver gan no mūsu klonu kolekcijas atlasītos antigēnus, gan arī vairākus no jauna klonētus antigēnus, un izgatavots fokusēts prostatas vēža antigēnu mikročips.
• Tika turpināts darbs pie antigēnu mikročipu un Luminex xMAP mikrosfēru tehnoloģiju salīdzināšanas – noskaidrota abu tehnoloģiju signāla/fona attiecība, variācija starp eksperimentiem, variācija starp replikātiem utt.
• Iesākts darbs pie rekombinanto proteīnu producēšanas un seroloģisko testu prototipu izstrādes.
• Iegūtie rezultāti prezentēti 4 starptautiskās konferencēs.

Līdz 2013. gada jūnijam:

• Tika turpināts darbs pie seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas veidošanas, kas tālāk tiks izmantota autoantivielu testu prototipu testēšanai;
• Izgatavots fokusēts prostatas vēža antigēnu mikročips un tas testēts ar prostatas vēža un labdabīgas prostatas hiperplāzijas pacientu un praktiski veselu vīriešu seruma paraugiem, lai atlasītu diagnostiski un prognostiski nozīmīgākos antigēnus;
• Tika turpināts darbs pie rekombinanto proteīnu producēšanas, autoantivielu testu prototipu izgatavošanai;
• Iegūtie rezultāti prezentēti 10. Starptautiskajā Kuņģa Vēža kongresā.

Līdz 2013. gada septembrim:

• Tika turpināts darbs pie seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas veidošanas;
• Pabeigts darbs pie diagnostiski nozīmīgāko prostatas vēža antigēnu identificēšanas un diagnostikas biomarķieru modeļa izveides;
• Tika turpināts darbs pie rekombinanto proteīnu producēšanas un multipleksu seroloģisko testu prototipu izstrādes;
• Iegūtie rezultāti prezentēti 15. Starptautiskajā Imunoloģijas kongresā Milānā;
• Iznākusi publikācija par autoantivielu saistību ar prognozi kuņģa vēža pacientiem:

Silina K, Zayakin P, Ancans G, Kalnina Z, Meistere I, Pismennaya A, Leja M and Line A (2013). Autoantibody biomarkers for early detection and prognosis of gastric cancer. Front Immunol. doi:10.3389/conf.fimmu.2013.02.01082

• Tiek turpināts pie publikāciju sagatavošanas par autoantivielu lomu pret-vēža imūnajā atbildē un izmantošanu diagnostikā.

Līdz 2013. gada decembrim:

• Tika pabeigts darbs pie seruma paraugu un klīniskās informācijas biobankas veidošanas;
• Tika pabeigts darbs pie rekombinanto proteīnu producēšanas un multipleksu seroloģisko testu prototipu izstrādes un testēšanas; noskaidroti to tehniskie un diagnostiskie rādītāji;
• Iegūtie rezultāti prezentēti 3 starptautiskās konferencēs;
• Sagatavoti un iesniegti divi publikāciju manuskripti:

1. Siliņa K, Rulle U, Kalniņa Z, Linē A. Targeting B cells in the context of tumour-associated tertiary lymphoid structures – a novel anti-cancer treatment avenue. (submitted to: Cancer Immunol Immunother)
2. Meistere I, Kalniņa Z, Siliņa K, Linē A. Cancer-associated Autoantibodies as Biomarkers for Early Detection and Prognosis is Cancer: an Update. (submitted to: Current Cancer Therapy Reviews)