Jauns hepatīta B vīrusa infekcijas modelis un pretvīrusa līdzekļu izvērtēšanas tehnoloģija
Projekts tiek īstenots ERAF 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros
Projekta vienošanās Nr. 2010/0230/2DP/2.1.1.1.0/10/APIA/VIAA/075
Projekta izpildes termiņš: 36 mēneši (01.10.2010.-31.09.2013.)
Projekta kopējais finansējums: 398240 LVL
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr.biol. T. Kozlovska
Projekta īstenošanas vieta ir APP Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs, BMC Projekta sadarbības partneri – „Cilmes šūnu tehnoloģijas” SIA un V/a “Latvijas Infektoloģijas centrs”
Projekta vispārīgais mērķis
radīt principiāli jaunu cilvēka Hepatīta B vīrusa (HBV) infekcijas modeli un pretvīrusa terapijas izvērtēšanas tehnoloģiju.
Projekta specifiskais mērķis
cilvēka cilmes šūnu hepatogēna diferenciācija un jauna HBV infekcijas modeļa izstrāde uz diferencēto hepatocītu un/vai to priekšteču bāzes.
Pamatojoties uz projekta mērķi, izstrādātās tehnoloģijas izmantošana attiecas gan uz HBV infekcijas profilaksi, gan terapijas uzlabošanu, kas tiks veikta citu pētījumu ietvaros.
Projekta ietvaros plānotas šādas aktivitātes:
1. Pētniecība:
1.1. Rūpnieciskais pētījums:
1.1.1. HBV infekcijas metožu izstrāde aktīvai kontrolei.
1.1.2. HBV jutīgas in vitro sistēmas izveides pilnveidošana;
1.1.3. HBV jutības parametru eksperimentālas noteikšanas metodoloģijas izstrāde.
2. Pētniecības rezultātu publiskas pieejamības nodrošināšana
3. Pētniecības rezultātu rūpnieciskā īpašuma tiesību nostiprināšana – patentpieteikums
Projekta rezultātā
tiks izveidota jauna aknu patoloģiju ārstniecības kontroles tehnoloģija, kas uzlabos ārstnieciskās terapijas izstrādi un izvēli, būs izmaksu efektīva un pietuvināta indivīdam.
Atskaites:
Līdz 31.08.2011:
Aktivitāte Nr.1.1. No pacientu asins sēruma HBV iegūšanu un 5 paraugu atlasi pētījumiem
Šajā atskaites periodā no desmit vīrushepatīta B pacientu (diagnoze apstiprināta, nosakot HBV antigēnus asinīs) asins serumiem tika izolēta hepatīta B vīrusa (HBV) DNS un ar polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) palīdzību veikta genotipēšana, kā arī noskaidrota DNS primārā struktūra (tajā skaitā konstatētas mutācijas) būtiskākajās HBV genoma pozīcijās (preS/S gēns, preC/C gēns). Pacienta serumā arī noteikts vīrusa titrs. Tālākajam darbam tika atlasīti pieci HBV paraugi: 1) A genotipa vīruss ar konservatīvu genomu, vīrusslodze 3.2 E6 IU/ml; 2) D genotipa vīruss ar konservatīvu genomu, vīrusslodze 1.14 E6 IU/ml; 3) E genotipa vīruss ar konservatīvu genomu, vīrusslodze 2.0 E4 IU/ml; 4) D genotipa vīruss ar mutantu genomu (6 aminoskābju gara delēcija preS2 seruma albumīna saistības rajonā, vakcinācijas rezistenci izraisoša mutāciju S gēna kodētā proteīna 145.pozīcijā), vīrusslodze 1.11 E3; 5) D genotipa vīruss ar mutantu genomu (pretvīrusa līdzekļa lamivudīna rezistenci nosakoša mutācija HBV polimerāzes 204. pozīcijā), vīrusslodze 3.59 E7 IU/ml. Šie genomi tika izvēlēti tādēļ, lai novērtētu Latvijā cirkulējošu „savvaļas” HBV variantu īpašības, kā arī lai noskaidrotu klīniski potenciāli būtisku mutāciju ietekmi uz vīrusa funkcionalitāti.
Aktivitāte Nr.1.2. HBV ekspresijas noteikšanu
Šajā atskaites periodā aktivitāte netiek uzsākta.
Aktivitāte Nr.2.1. kontrolei HBV iegūšanu šūnu kultūrā (kHBV) un kHBV antigēnu ekspresijas noteikšanu
Šajā atskaites periodā tika iegūts kHBV vīruss no HepG2.2.15 HBV producējošas šūnu kultūras. Izmantojot antiHBs un antiHBe ELISA metodi tika noteikti HBV antigēni kHBV paraugā. Vīrusa titrs tika kvantificēts ar reāla laika PCR metodi.
Aktivitāte Nr.2.2. alfavīrusa vadītas kHBV ekspresijas noteikšanu šūnu kultūrā
Šajā atskaites periodā tika sintezēts rekombinatais alfavīruss pSFV1/HBVpgRNA. Vīrusa aktivitāte tika pārbaudīta HepG2 šūnās.
Aktivitāte Nr.2.3. Produkta pasāžas (Pn) izvēli
Šajā atskaites periodā Produktam 6 pasāžā tiek noteikta kHBV infekcijas iespējamība, par ko tiek gatavota publikācija. Tika novērots: HBV mRNS sintēze; HBV genomu cccDNS veidošanos; HBc antigēna kodola lokalizācija; HBs antigēnu sekrēcija.
Aktivitāte Nr.3.1. mezenhimālo cilmes šūnu iegūšanu jauna Produkta izstrāde
Šajā atskaites periodā tika iegūti paraugi no 5 personām (katra parauga iesaldēšana 10 kriosalmiņos) tika noteikta paraugu atbilstība cilmes šūnām, pluripotences faktoru ekspresija. Tika izvēlēts viens Produkta kandidāts (cilmes šūnas, kuras spējīgas inficēties ar kHBV). Produkta kandidāts tika savairots un sasaldēts pasāžās 6 un 9, lai sekojoši izvēlētos Produkta optimālo pasāžu (Pn).
Līdz 2012. gada aprīlim:
Lai pētītu 5 atlasīto HBV genomu (izdalīti no: A genotipa vīrusa ar konservatīvu genomu, D genotipa vīrusa ar konservatīvu genomu, E genotipa vīrusa ar konservatīvu genomu, D genotipa vīrusa ar mutantu genomu – delēciju preS2 seruma albumīna saistības rajonā un vakcinācijas rezistenci nosakošu mutāciju S gēnā un D genotipa vīrusa ar pretvīrusa līdzekļa lamivudīna rezistenci) replikāciju, šajā atskaites periodā, pamatojoties uz ilgtermiņa pieredzi eikariotisko šūnu transfekcijas pētījumos, optimizēta pilna garuma cirkularizēto HBV genomu transfekcijas metode hepatomu šūnu līnijās. Tika atrastas optimālās DNS un transfekcijas reaģentu koncentrācijas, kas noved pie maksimālas hepatomu šūnu līniju transfekcijas efektivitātes. Paralēli uzsākti pētījumi par principiāli jaunu metodi – cilmes šūnu transfekciju uz nukleofekcijas bāzes.
Turklāt, izmantojot alfavīrusu replikona sistēmu, D1 un D2 genotipa HBV pregenoma (pg) RNS ekspresēts BHK-21 (baby hamster kidney) un HepG2 (human hepatoma cells) šūnās. Pētīta HBV kapsīdproteīna (HBc) proteīna lokalizācija inficētās šūnās, kas parādīja pārsvarā citoplazmātisku HBc lokalizāciju pie agrīniem (12 stundas) pēcinfekcijas laikiem. Parādīts, ka HBc proteīna pašsavākšānas šūnās noved pie HBc nukleokapsīda (core) daļiņas izveidošanās. Raksturojot HBV pgRNS noskaidrots, ka core daļiņas satur HBV genomu DNS formā, kas spēj veidoties no pgRNS molekulas apgrieztās transkripcijas rezultātā, kuru veic endogēnā HBV polimerāze nukleokapsīda iekšienē. Reālā laika PCR analīzes dati liecina, ka BHK-21 un HepG2 šūnu lizātu kodola un citoplazmātiskās frakcijas satur detektējamu HBV DNS genomu daudzumu agrīnos un vidējos pēcinfekcijas laikos.
Papildus, pārbaudīts no pacienta (Nr.4.B) taukaudiem izdalīto cilmes šūnu (ADSC ) dubultošanās ātrums no 3. līdz 10. pasāžai barotnē ar 5% autologu sērumu (AS). Katra pasāža ilga vienu nedēļu un noteikts, ka vidējais šūnas dubultošanās ātrums ir 40±4 stundas, atkarībā no pasāžas. Salīdzinot no trīs pacientiem izdalītās un komerciālās ADSC, redzams, ka visos gadījumos šūnas ir vārpstveida un tās pēc morfoloģijas var raksturot kā tipiskas mezenhimālās cilmes šūnas (MCŠ). Vienīgā novērotā atšķirība ir citoplazmātisko granulu veidošanās šūnās, kas audzētas barotnēs ar AS, neatkarīgi no tā daudzuma.
Līdz 2012. gada oktobrim:
Izstrādāta metode (M1) – cilvēka HBV daļiņu izdalīšana no šūnu kultūras barotnes un cilvēka asinīm. Tika izmantota HepG2.2.15 šūnu kultūra, kas producē HBV, un vīrushepatīta B pacientu asins serumi. Vīruss tika iegūts pielietojot saharozes gradienta ultracentrifugācijas metodi. Pēc ultracentrifugēšanas savāktās frakcijas tika analizētas, izdalot no tām DNS un veicot PCR analīzi ar HBV DNS specifiskiem praimeriem, lai noskaidrotu vīrusa koncentrēšanas rezultātu. Augstākā HBV DNS koncentrācija tika konstatēta gradienta frakcijās 3-7, gadījumā ja vīruss bija izdalīts no šūnu kultūras barotnes. Izdalot vīrusu no pacienta asins seruma, vīrusa DNS (vērtējot tā daudzumu) bija atrodama visās frakcijās, kas izskaidrojams ar stipri lielāko HBV izejas daudzumu un iespējamo vīrusu daļiņu izjaukšanu attīrīšanas gaitā. HBV daļiņu saturošās frakcijas tika apvienotas un dializētas, lai atbrīvoties no saharozes pārpalikumiem. Pārbaudot dializētās frakcijas elektronmikroskopijā, tika konstatēts, ka frakcijas 3-7 satur attīrītu vīrusu (Deina daļiņas) un, ka specifisku piemaisījumu, vīrusa nukleokapsidus, bet gradienta augstākajās frakcijas sastopami dažādi nespecifiski piemaisījumi, ka arī HBV apvalku proteīnu veidotas subvirālās daļiņas. Iegūtie vīrusa preparāti tika verificēti ar Western blotā metodi izmantojot vīrusa apvalka proteīna preS1 specifiskas antivielās MA18/7. HBV daudzums attīrītā preparātā tika noteikts ar reālā laika kvantitatīvās PCR metodes palīdzību. Tika pārbaudīta attīrītā HBV preparāta infekcijas aktivitāte cilvēka mezinhimalas cilmes šūnās un no tām veidotas hepatogenas virziena differencietas šūnas stadija H2. Sākotnējie rezultāti liecina, ka 3. un 6. dienā pēc HBV infekcijas ar reversās transkripcijas nested-PCR palīdzību ir konstatējama HBV pregenomiskās RNS veidošanās šūnās (cilmes un H2 šūnās), kas inficētas ar no pacienta seruma attīrīto vīrusa preparātu, bet ne ar neapstrādātu pacienta serumu inficētajās šūnās. Šis rezultāts apliecina izstrādātās metodes M1 efektivitāti un var liecināt par infekciju inhibējošu faktoru klātbūtni pacienta asins serumā. HBV RNS-pozitīvajiem paraugiem tika konstatēta arī HBs antigēna sekrēcija šūnu barotnē.
Līdz 2012. gada decembrim:
Šajā atskaites posmā tika:
1) pārbaudīta mezenhimālo cilmes šūnu (6.pasāža ) un šūnu pirmajā hepatogēnās diferenciācijas stadijā (H2) spēja inficēties ar HBV, un pētījumu rezultāti liecina par HBV replikācijas marķieru (cccDNS, mRNS) parādīšanos abu tipu šūnās infekcijai izmantojot dažādās izcelsmes un dažādas tīrības pakāpes HBV preparātus;
Īss pētījuma apraksts
Tika izmantoti šādi vīrusa preparāti: (1) vīrusu producējošas kultūras HepG2.2.15 HBV (koncentrēts ar PEG), (2) HepG2.2.15 HBV, attīrīts saharozes gradientā, (3) vīrushepatīta B pacienta (VHB) 23HBV serums, (4) pacienta 23HBV vīruss, attīrīts saharozes gradientā, (5) VHB pacienta 24HBV serums, (6) 24HBV vīruss, attīrīts saharozes gradientā. Abu pacientu vīrusam noteikta piederība A genotipam, HepG2.2.15 vīruss pieder D genotipam (A un D genotips pieder pie Latvijā prevalējošajiem HBV genotipiem).
HBV infekcijai cilmes šūnas un H2 šūnas ~24h tika inkubētas infekcijas vidē ar HBV. Materiāls infekcijas efektivitātes pārbaudei tika savākts 3., 6. un 9.dienā pēc inficēšanas: (1) šūnu lizāti tika izmantoti – HBV RNS, HBV DNS un HBV antigēnu noteikšanai; (2) šūnu lizātu kodola frakcijās tika izmantotas HBV cccDNS noteikšanai; (3) šūnu augšanas barotnes tika izmantotas sekretejamo HBV produktu noteikšanai .
HBV nonākšana šūnās tika konstatēta visos veiktajos infekcijas eksperimentos, kas noteikts pēc vīrusa cccDNS veidošanās šūnu kodolos, kā arī HBV DNS klātbūtnes šūnu citoplazmā (izmantota PCR un nested-PCR metode). Tomēr tika secināts, ka gan cilmes šūnās, gan H2 šūnās HBV replikācijas norise ir apgrūtināta vai notiek zemā līmenī atkarībā no izmantotā vīrusa preparāta īpašībām.
2) ar gēnu inženierijas metodēm konstruēti un no šūnu kultūrās attīrīti SFV/HBV vīrusi, kas kodē no pacientiem izdalītus HBV genomus un HBV replikācijas un HBV strukturālo proteīnu ekspresijas pētījumiem mezenhimālo cilmes šūnu (6.pasāža ) un šūnu pirmajā hepatogēnās diferenciācijas stadijā (H2) tika inficētas ar šiem vīrusiem, izmantojot rekombinanto SFV/EGFP vīrusu ( vīrusu ar zaļi fluorescējušo proteīna gēnu) kā infekcijas markieri.
Īss pētījuma apraksts
Mūsu pētījumi parādīja, ka: (1) gan mezenhimālas cilmes šūnas , gan šūnas H2 hepatogēnās diferenciācijas stadijā ir permisīvas pret alfavīrusu infekciju, jo jau pēc 24h ir iespējams novērot inficētajās cilmes šūnās GFP fluorescenci; (2) GFP- fluorescences analīze rāda, kā cilmes šūnu konglomerāti un H2 šūnas labāk inficējas ar alfavīrusiem. Šīs efekts bija pamanāms jau 24h pēc infekcijas. (3) citotoksicitātes testu rezultāti liecina par vienādi stipru rekombinantu alfavīrusu citotoksisku efektu uz visu veidu cilmes šūnām neatkarīgi no to diferenciācijas pakāpes; (4) Inficējot cilmes šūnas gan ar SFV/GFP, gan ar Sindbis/GFP, starpība starp vīrusu efektiem uz inficētajām šūnām netika pamanīta.
Līdz 2013. gada aprīlim:
Šajā atskaites posmā tika turpināts darbs pie HBV replikācijas pētījumiem in vitro. HBV genomu varianti : (1) A genotips/adw2 subtips, savvaļas tipa genoms, (2) D genotips/ayw3 subtips, savvaļas tipa genoms, (3) E genotips/ayw4 subtips, savvaļas tipa genoms, (4) D genotips/ayw2 subtips, mutants genoms (satur lamivudīna rezistenci izraisošu mutāciju P gēnā), tika izolēti no individuāliem pacientiem, klonēti pJET1.2 vektorā, speciāli amplificēti replikācijas pētījumiem un ievadīti hepatogēnā virzienā diferencētās mezenhimālās cilmes šūnās ar jaunu nukleofekcijas metodi. Šūnu monoslāņu lizāti un barotnes tika analizēti uz HBV specifisko proteīnu sintēzi HBs un HBe ELISA testos. Iegūti pirmie dati par HBV genomu variantu replikatīvo aktivitāti cilvēka cilmes šūnās. Nukleofekcijas eksperimenti ar individuāliem HBV genomu paraugiem tiks turpināti ar nolūku optimizēt HBV specifisko produktu (proteīnu un DNS) sintēzi pacienta cilmes šūnās.
Līdz 2013. gada 30. septembrim
Projekta noslēguma posmā tika veiktas atkārtotas HBV modeļsistēmas pārbaudes, nosakot HBV paraugu ekspresijas novērtēšanu Pn (Produktam). Sagatavota publikācija un patentpieteikums „Paņēmiens hepatīta B vīrusa infekcijas modeļa izveidošanai” (Patenta pieteik. P-13-114).
Izgudrojums attiecas uz hepatīta vīrusu, jo īpaši uz hepatīta B vīrusa (HBV) in vitro infekcijas modeļa izveidošanu molekulārās bioloģijas un biotehnoloģijas jomā. Izgudrojums ir izmantojams kā HBV infekcijas modelis specifiskai pretvīrusa terapijas efektivitātes izvērtēšanai un jaunu pretvīrusa preparātu izveidošanai.