Jauna cikliska augšanas hormona preparāta sintēze un validācija

Projekta nosaukums: „Jauna cikliska augšanas hormona preparāta sintēze un validācija”

Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros

Projekta identifikācijas Nr.: 2014/0012/2DP/2.1.1.1.0/14/APIA/VIAA/038

Projekta izpildes termiņš: 13 mēneši (2014.gada 1.augusts – 2015.gada 31.augusts)

Projekta kopējais finansējums: 160 036,00 EUR

Projekta zinātniskais vadītājs: Dr.biol. A.Leončiks

Projekta vispārīgais mērķis ir jauna modificēta cilvēka augšanas hormona (AH) jeb somatotropīna izveide slimību ārstēšanai, kas saistītas ar hormona deficītu organismā.

Projekta specifiskais mērķis ir cikliska somatotropīna sintēze un tā bioloģiskās aktivitātes pārbaude in vivo modelī. 

Informācija publicēta: 03.08.2014.

Periods: 01.08.2014.-31.10.2014.

Projekta sākuma etapā ir izveidotas ciklizācijai paredzētās somatotropīna gēna ģenētiskās konstrukcijas, kur AH proteīna izoformu N- un C-gali ir savienoti ar dažāda garuma un kompozīcijas aminoskābju linkeriem. Pavisam ir paredzēts izveidot trīs dažādas cikliskas AH izoformas ar 9, 15 un 20 aminoskābju gariem linkeriem, kur katrai no norādītajām izoformai papildus vēl tiks izveidots atsevišķs variants ar albumīna atpazīšanas 18 aminoskābju garu sekvenci, kuru ievietos starp proteīna N-galu un specifiskā linkera sekvenci. Rezultātā tiks iegūtas sešas rekombinantas ciklizācijai paredzētās AH ģenētiskās konstrukcijas un viena AH lineārā konstrukcija.

Pirmās no iegūtajām ciklizācijai paredzētajām AH konstrukcijām ir pārbaudītas proteīna analītiskai ieguvei bakteriālā ekspresijas sistēmā. Ņemot vērā proteīna daļējo šķīdību, tiek veikts darbs, lai optimizētu ciklizētās formas iznākumus un palielinātu enzimātiski aktīvās šķīstošās daļas īpatsvaru.

 Paralēli ciklizētā hormona izoformu bakteriālās ekspresijas pārbaudēm, tiek veikti izdalītā proteīna hromatogrāfiskās attīrīšanas izmēģinājumi, lai optimizētu aktīvā preparāta iegūšanas un izdalīšanas procedūras. Papildus ir uzsākts arī darbs, lai atlasītu labāko AH producenta bakteriālo celmu, kas būtu vislabāk pielāgots rekombinantā mērķproteīna ekspresijai preparatīvos daudzumos liela mēroga ražošanai. 

Periods: 01.11.2014.-31.01.2015.

Projekta otrajā etapā tika pabeigta visu somatotropīna gēna ģenētisko konstrukciju izveide ekspresijai bakteriālā ekspresijas sistēmā. Pavisam tika izveidotas sekojošas cilvēka augšanas hormona (AH) gēnu konstrukcijas: trīs ciklizācijai paredzētas AH izoformas ar 9, 15 un 20 aminoskābju gariem linkeriem, un trīs papildus AH izoformas ar trim dažāda garuma linkeriem un albumīna (18 aminoskābju atlikumi) atpazīšanas sekvenci. Rezultātā ir iegūtas visas nepieciešamās sešas konstrukcijas, kas paredzētas ciklizēta AH produkta ieguvei un viena ģenētiska konstrukcija lineāra proteīna ekspresijai.

Visas izveidotās ciklizētā AH konstrukcijas tika analizētas vairākās bakteriālās ekspresijas sistēmās, lai noskaidrotu proteīnu ekspresijas apstākļus, un izvērtētu iegūtā materiāla daudzumu un produkta šķīdību. Ņemot vērā ciklizētā produkta augsto nešķīstošās daļas īpatsvaru, kas būtiski ietekmē tā enzimātisko un bioloģisko aktivitāti, tiek veikts darbs, lai optimizētu proteīna ieguves apstākļus ar nolūku palielināt šķīstošās formas īpatsvaru no kopējā ekspresētā mērķproteīna daudzuma.

Tālākajam uzdevumam, lai varētu izvērtēt izdalīto produktu bioloģisko aktivitāti, ir sagatavota prolaktīna atkarīga Nb2 limfomas šūnu līnija, ar kuras palīdzību noskaidros izveidoto AH konstruktu ietekmi uz šūnas augšanas kinētiku.

Paralēli ciklizētā hormona izoformu bakteriālās ekspresijas un šķīdības pārbaudēm, tiek turpināti izmēģinājumi ar iegūtā proteīna hromatogrāfiskās attīrīšanas procesiem, lai varētu optimizēt aktīvā preparāta izdalīšanas procedūru un noskaidrotu tam nepieciešamās metodes. Tāpat turpinās arī darbs, lai atlasītu labākos AH producentu celmu ar visaugstāko rekombinantā mērķproteīna ekspresiju, ko varētu tālāk izmantot preparatīvu daudzumu iegūšanai. 

Periods: 01.02.2015.-30.04.2015.

Projekta trešajā etapā tika turpināts iepriekš uzsāktais darbs ar izveidoto cilvēka augšanas hormona (somatotropīna) ciklizācijai paredzēto izoformu ekspresiju bakteriālā sistēmā. Visas izveidotās gēnu konstrukcijas ar dažāda garuma linkeriem starp inteīna saitiem (9, 15 un 20 aminoskābju atlikumi) un papildus albumīna sekvenci (18 aminoskābju atlikumi), tika izmantotas proteīnu sintēzes eksperimentiem, kuros analizēja ciklizētā augšanas hormona (AH) sintēzes intensitāti un apstākļus, kā arī proteīna stabilitāti un šķīdību. Pavisam ir veiktas vai tiek turpinātas pārbaudes ar ciklizētā AH kodējošās sekvences konstruktiem sešās dažādās vektoru sistēmās (attiecīgi ar T7, T5 un cspA promoteriem) un četrās E.coli bakteriālās ekspresijas sistēmās.

Ņemot vērā ciklizētā produkta augsto nešķīstošās daļas īpatsvaru, kas būtiski ietekmē tā enzimātisko un bioloģisko aktivitāti, tiek turpināts darbs, lai optimizētu mērķproteīna ieguves apstākļus ar nolūku palielināt tā šķīstošās formas īpatsvaru no kopējā ekspresētā ciklizētā proteīna daudzuma. Tāpat, papildus tiek analizēti apstākļi, lai palielinātu ekspresētā AH proteīna stabilitāti un viendabību dažādos bufera šķīdumos attīrīšanas un refoldinga procedūru laikā.

Izmantojot pirmos analītiski iegūtos attīrītā un refoldētā cikliskā AH paraugus, ir veiktas sākotnējas šūnu augšanas (proliferācijas) pārbaudes, lai noskaidrotu izdalīto AH izoformu bioloģiskās aktivitātes potenciālu, izmantojot šim nolūkam prolaktīna atkarīgu Nb2 limfomas šūnu līniju. Sākotnējie rezultāti norāda, ka sagatavotajiem paraugiem piemīt specifiska bioloģiska aktivitāte, taču šūnu augšanas stimulāciju būtiski ietekmē izdalītā AH preparāta viendabības pakāpe, kura savukārt ir tieši atkarīga no iegūtā gala produkta stabilitātes, kuru nepieciešams papildus analizēt.

Kā otrs galvenais virziens, kas joprojām tiek aktīvi pētīts ir ciklizētā hormona izoformu bakteriālās ekspresijas un šķīdības pārbaudes ar nolūku optimizēt specifiskā proteīna hromatogrāfiskās attīrīšanas procesus un noskaidrotu tam nepieciešamās metodes, lai rezultātā varētu iegūt iespējami lielāko daudzumu maksimāli attīrīta un aktīva gala preparāta. Tāpat tiek turpināts arī darbs ar labāko AH producentu celmu ar augstāko rekombinantā mērķproteīna ekspresiju atlasi, lai šādi atlasītus producentus varētu izmantot mērķproteīna preparatīva daudzuma ieguvei. 

Periods: 01.05.2015.-31.08.2015.

Projekta ceturtajā etapā tika pabeigtas visu iepriekš izveidoto ģenētisko konstrukciju bakteriālās ekspresijas pārbaudes, kur ciklizācijai paredzētās cilvēka augšanas hormona (somatotropīna) sekvences bija iebūvētas starp mini-inteīna kodējošiem domēniem. Pavisam tika analizētas piecas atšķirīgas vektoru sistēmas ar attiecīgi T7, T5 un csp promoteriem un četras dažādas E.coli bakteriālās ekspresijas sistēmas (celmi).

Galvenais darbības virziens pēdējā posmā bija ciklizēto augšanas izoformu šķīdības un bioloģiskās aktivitātes palielināšana, lai rezultātā iegūtu mērķproteīnu ar augstu stabilitāti. Šim nolūkam tika pārbaudīti dažādi apstākļi, kuri nosaka proteīna stabilitāti dažādos buferu šķīdumos, mainot hormona preparātu izdalīšanas, renaturācijas un dialīzes protokolus, kuru izpildes rezultātā tika pārbaudīta dažādu stabilizējošu vielu klātbūtnes efekts šķīdumā, kā arī papildus reducējošu apstākļu ietekme uz proteīna izoformu stabilitāti un oligomerizāciju.

Rezultātā, izmantojot stabilāko un hromatogrāfiski vislabāk attīrīto izoformu preparāti tika analizēti, lai noskaidrotu ciklizētā hormona bioloģisko aktivitāti, tā spēju stimulēt somatotropīna atkarīgu šūnu augšanu. Šim nolūkam tika izmantotas prolaktīna atkarīgas Nb2-11 šūnas, kurām pievienoja dažādās koncentrācijas ciklizētā augšanas hormona izoformas ar dažādu linkera garumiem, kā arī ar iebūvētu albumīna saistīšanās peptīda sekvenci. Pārbaudes rezultāti demonstrēja, ka augstāka šūnu proliferācijas aktivitāte piemīt hormona izoformām ar iebūvētu albumīna saistīšanos peptīdu, savukārt papildus linkera sekvences būtiski neietekmēja proteīna specifisko bioloģisko aktivitāti.

Otrs galvenais projekta darba virziens, kas tika tālāk pētīts, ir saistīts ar ciklizētā hormona dažādo izoformu bakteriālās ekspresijas un proteīna šķīdības palielināšanu, kā arī tālāku labāko ciklizētā proteīna producentu celmu noskaidrošanu un to atlasi. Paralēli proteīna ekspresijas pētījumiem, tika veikti metodoloģiski pētījumi, lai optimizētu un vienkāršotu mērķproteīna hromatogrāfiskās attīrīšanas procedūras, kuras nākotnē varētu pielāgot ciklizētā augšanas hormona preparatīvu daudzumu ieguvei.