Sortāzes inhibitoru atlase antimikrobiālās terapijas nolūkiem
Projekts tiek īstenots ERAF 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros
Projekta vienošanās Nr. 2010/0312/2DP/2.1.1.1.0/10/APIA/VIAA/032
Projekta izpildes termiņš: 36 mēneši (01.01.2011.-31.12.2013.)
Projekta kopējais finansējums: 456491 LVL
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr.biol. A. Leončiks
Projekta īstenošanas vieta ir APP Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs, sadarbības partneris SIA „LabochemLV”.
Grampozitīvās baktērijas Staphylococcus aureus, S epidermidis un enterokoki arvien biežāk kļūst par nozokomiālo (intrahospitālo) slimību izraisītājiem (Friedman, 2002). Šādu slimību ārstēšana ir apgrūtināta, jo klīnikās sastopamie patogēni parasti ir rezistenti pret konvenciālām antbibiotikām. S. aureus rezistento celmu, ieskaitot MRSA, kā arī citu grampozitīvo patogēnu izplatīšanās problēmas risināšanai ir nepieciešams izstrādāt arvien jaunus antibakteriālos līdzekļus. Par vienu no pievilcīgākajiem antibakteriālās terapijas mērķiem tiek uzskatīts grampozitīvo baktēriju šūnapvalka enzīms sortāze A (srtA). Enzīmam ir būtiska loma daudzu grampozitīvo baktēriju virsmas proteīnu kovalentā piestiprināšanā pie šūnapvalka, tādejādi nodrošinot patogēna izdzīvošanu un vairošanos saimniekorganismā. Savukārt baktērijām ar mutācijām sortāzes A gēnā nav vai arī ir stipri samazinātas spējas inficēt saimniekorganismu (Mazmanian, 2000). Pašlaik sortāzi inhibējošās vielas tiek meklētas izmantojot vairākas pieejas. Starp tām ir i) augu ekstraktu hromatogrāfijas frakciju skrīnings un inhibējošo vielu identifikācija (Kim et al. 2002); ii) inhibitoru struktūru izveidošana in silico, pamatojoties uz strukturalajām zinašanām par sortāzes aktīvo centru un pārejas stāvokļa konfigurāciju (Frankel, 2004); iii) mazmolekulāro vielu bibliotēku skrīnings, kurai ir tādas būtiskas priekšrocības kā atlases ātrums un augsta caurlaidspēja (Maresso, 2007).
Mērķis
Projekta vispārīgais mērķis ir jaunu antibakteriālo vielu atlase un modifikācija grampozitīvo mikroorganismu apkarošanai. Projekta specifiskais mērķis ir grampozitīvo baktēriju šūnapvalka enzīma sortāzes A inhibitoru atlase ar gala pārbaudi dzīvnieku modelī. Projekta realizācija paredz atlasīt jaunus ķīmiskus savienojumus ar sortāzes A inhibitorām spējām un antibakteriālām īpašībām, kuras varētu tikt patentētas un uz to bāzes radītas jaunas zāles grampozitīvo baktēriju slimību ārstēšanai
Uzdevumi
1. Jaunu antibakteriālo vielu – sortāzes A inhibitoru atlase. Projekta ietvaros problēmas risinājums ietver grampozitīvo baktēriju šūnapvalka enzīma sortāzes A inhibitoru atlasi, izmantojot šim nolūkam mazmolekulāru ķīmisko savienojumu bibliotēkas.
2. Sortāzes-inhibitora kompleksu struktūru iegūšana un inhibitoru dizains in silico. Inhibēšanas procesa dziļākai izpratnei ir paredzēts izmantot kodolmagnētiskās rezonanses un kristalogrāfijas datus. Pamatojoties uz zināšanām par vielu struktūrām būs iespējams veikt potenciālo inhibitoru struktūras uzlabošanu ar mērķi palielināt inhibēšanas konstantes.
3. Inhibitoru efektivitātes noteikšana in vitro un in vivo. Efektivitātes noteikšana ietver gan in vitro eksperimentus, izmantojot rekombinanto sortāzi A un fluorescentus peptīdu dabas substrātus, gan pārbaudi dzīvniekos in vivo, ar mērķi noskaidrot potenciālo kandidātu toksiskumu LD50, kā arī izpētīt infekcijas izplatīšanos dzīvnieku modelī atklāto antibakteriālo vielu klātbūtnē.
Sagaidāmie rezultāti
Projekta īstenošanas rezultātā tiks atlasīti un ķīmiski modificēti savienojumi, kuriem piemīt jaunas kvalitatīvas īpašības, kas raksturos jauniegūto preparātu spēju tikt sekmīgi pielietotiem kā potenciāliem farmaceitiskiem līdzekļiem pret grampozitīvo baktēriju izraisītajām slimībām. Otrs aspekts, kas paralēli tiks īstenots projekta gaitā, būs jaunas atlasīto vielu ķīmiskās sintēzes tehnoloģijas izstrāde. Jauna tehnoloģija tiks attīstīta ar mērķi pēc iespējas samazināt atlasīto ķīmisko savienojumu sintēzes procesa enerģijas un materiālu patēriņu.
Atskaites:
2011. gada aprīlis-jūnijs
Tika izveidota jauna ģenētiska srtA ekspresijas konstrukcija un veiksmīgi sintezēts sortāzes A katalītiskais domēns, kas nesatur histidīna iezīmi, kuru paredzēts izmantot turpmākajos rentgenkristalogrāfijas pētījumos. Šāda nemodificēta proteīna struktūra, kuru pārstāv sortāzes katalītiskā domēna neiezīmētā forma, ir maksimāli tuva natīvai fermenta uzbūvei un tādejādi vislabāk piemērota enzīma-inhibitora kompleksa struktūrpētījumiem. Papildus ģenētiskās konstruēšanas darbiem ir arī optimizēti enzīma domēna ekspresijas un attīrīšanas apstākļi un izveidots proteīna attīrīšanas protokols.
Analizējot in silico sortāzes inhibitoru kandidātus, ir tikuši izveidoti (definēti) potenciāli savienojumi, kuriem ir veikts vielu sintēzes pasūtījums. Ar šādi iegūtu ķīmisko savienojumu bibliotēku ir uzsākti pirmie piloteksperimenti, lai optimizētu nepieciešamās augstas caurlaidspējas skrīninga procedūras. Šādos eksperimentos kā fluorescences references reakciju standarti tiek izmantoti peptīdi, kas satur EDANS un DANSYL fluoroforus. Eksperimentāli, mērot fluorescences intensitātes, ir noteiktas fluoroforu un fluorescento peptīdu optimālās koncentrācijas srtA katalizētajās enzimātiskajās reakcijās.
Projekta sortāzes inhibīcijas procesu kontrolei un validācijai ir paredzēts izmantot zināmus enzīma inhibitorus – berberīna hlorīdu un fenilvinilsulfonu. Izmantojot šādas zināmas inhibitoras vielas un vairākus ķīmiskos savienojumus ar potenciālām inhibitorām spējām, ir veikti pirmie sortāzes inhibīcijas kinētikas eksperimenti, kuru rezultāti ļaus pilnvērtīgāk izvērtēt pārbaudāmo inhibitoro savienojumu īpašības.
2011.g. septembris – 2012.g. februāris
tika veikts ķīmisko vielu bibliotekas skrīnings izmantojot fluorescences atlases sistēmu ar nolūku atlasīt perspektīvākos sortāzes A inhibitorus ar maksimālo enzimātiskās inhibīcijas efektu. Šim nolūkam tika izmantota biblioteka ar vairāk kā 50000 dažādu mazmolekulāru savienojumu, kurus pārbaudīja pēc to spējas inhibēt FRET peptīda, kas satur sortāzes atpazīšanas sekvenci proteolītisku šķelšanu un enzimātiski aktīva sortāzi A, kuru ieguva bakteriāli sintēzējot. Sākotnējās atlases rezultātā ir pārbaudīti visi ķīmisko vielu bibliotēkas savienojumi un noskaidrotas to specifiskās inhibēšanas aktivitātes, kas ļauj izvēlēties turpmākajiem eksperimentiem labākos savienojumus ar augstāko sortāzes inhibēšanas efektu.
Lai varētu uzsākt nākamos plānotos pētījumus ar labākajiem atlasītajiem savienojumiem, kuros ir paredzēts analizēt inhibitoru un enzīma struktūru, enzīma-inhibitora kompleksu stabilitāti, kā arī analizēt labāko kandidātu citotoksicitāti, ir pabeigta iepirkuma procedūra – atklāts konkurss Nr. BMC 2012/312 “Aktīvu antibakteriālo līdzekļu kandidātu iegāde sortāzes inhibēšanas pētījumu vajadzībām”, kuras ietvaros tiks papildus sintezēts 81 ķīmiskais savienojums, kuri demonstrēja fluorescences atlases sistēmā visaugstāko sortāzes inhibēšanas efektivitāti.
Šajā atskaites periodā arī ir uzsākti pētījumi, lai noskaidrotu sortāzes A katalītiskā domēna bezhistidīna formas un histidīna formas ar trim references srtA inhibitoriem kristalizācijas apstākļus, kas ļaus tālāk noteikt un skaidrot sortāzes rentgenstruktūru un analizēt enzīma-inhibitora kompleksu mijiedarbību. Tāpat ir veiktas pirmās pārbaudes, lai varētu izveidot labāko kandidātsavienojumu citotoksicitātes testus, ar kuru palīdzību tālāk noteiks atlasīto un modificēto ķīmisko savienojumu toksiskumu izmantojot šūnu kultūru un dzīvnieku modeļus.
2012.g. marts – jūnijs
Projekta 5. atskaites periodā tika veikts atkārtots labāko ķīmisko vielu bibliotekas atlasīto savienojumu skrīngs izmantojot dažādus FRET peptīdus, lai pārliecinātos par iegūto rezultātu ticamību un noskaidrotu to statistisko atkārtojamību un variabilitāti. Papildus peptīdu skrīningam, perspektīvākie ķīmiskie savienojumi ar sortāzi A inhibējošo aktivitāti tika pārbaudīti standarta fluorescences atlases sistēmā izmantojot citu S. aureustranspeptidēšanas enzīmu – sortāzi B, lai varētu papildus spriest par izvēlēto vielu universālo spēju inhibēt dažādu sortāzes enzīmu katalītiskās aktivitātes. Nākamais, veicot kristalizācijas skrīninga testus ar bakteriāli sintezētu enzimātiski aktīvu bezhistidīna sortāzi A, ir izdevies iegūt proteīna kristālus, kurus pēc nepieciešamo papildus kvalitatīvo un kvantitatīvo parametru uzlabošanas, paredzēts izmantot tālāk ieplānotajiem rentgenstruktūras pētījumiem. Atskaites periodā ir uzsāktas citotoksicitātes un letālās devas pārbaudes uz trim dažādām šūnu līnijām labākajiem kandidātsavienojumiem, lai noskaidrotu vielu citotoksiskuma koncentrācijas un citus papildus raksturlielumus kā intracelulāro un metabolisko stabilitāti un šūnas membrānas caurlaidību. Līguma Nr. BMC2012/316 ietvaros ir uzsākti pirmie pētījumi 40 kandidātsavienojumu un iezīmēta srtA enzīma mijiedarbības noskaidrošanai izmantojot KMR, lai analizētu perspektīvāko inhibitoru saistības vietas uz enzīma virsmas, identificētu mijiedarbojošos sortāzes aminoskābju atlikumus, modelētu enzīma-inhibitoru kompleksu struktūras šķīdumos un veiktu enzīma-inhibitoru kompleksa trīsdimensionālās struktūras noteikšanu.
2012. g. jūlijs – oktobris
Projekta 6. atskaites periodā (2012.g. jūlijs – oktobris) labākajiem sortāzes A inhibitorajiem kandidātsavienojumiem veica modificētu skrīningu fluorescentajā atlases sistēmā, izmantojot īpašu ciklizētu srtA enzīmu, kam raksturīga paaugstināta enzimātiskā izturība vāji denaturējošos šķīdumos, lai šādi iegūtu papildus informāciju par sortāzes katalizētās reakcijas specifiskumu un inhibēšanas darbības mehānismiem.
Papildus S.aureus sortāzes fluorimetrsikajām pārbaudēm, labākos inhibitoros savienojumus atsevišķi testēja līdzīgā atlases sistēmā, taču izmantojot divu citu radniecīgu organismu B.anthracis un L.monocytogenes srtA enzīmus, kas ļāva sašaurināt labāko kandidātu skaitu, kā arī iegūt vairāk datu par atlasīto savienojumu inhibēšanas mehānisma specifiskumu.
Darbs tika turpināts arī sortāzes rentgenstruktūras modeļa skaidrošanā, šim nolūkam analizējot iegūto kristālu kvalitāti un izmantošanas iespējas struktūrālajiem pētījumiem. Papildus enzīma kristalizācijas testam, tika uzsākts darbs, lai izveidotu arī srtA un labāko inhibitoro savienojumu kokristalizācijas testus, lai varētu vispusīgāk analizēt iegūtos enzīma un inhibitoru mijiedarbības modeļus un izmantot šos datus tālākajiem kandidātsavienojumu atvasinājumu sintēzes darbiem.
Atskaites periodā labākajiem 40 atlasītajiem savienojumiem skaidroja vielu toksiskuma un letālās koncentrācijas izmantojot cilvēka fibrosarkomas un hepatomas, kā arī peļu fibroblastu šūnu līnijas. Papildus ir uzsāktas pārbaudes, lai noskaidrotu šo vielu metabolisko stabilitāti un šūnas membrānas caurlaidību, kā arī minimālās mikroorganismu augšanas un proliferācijas inhibējošās koncentrācijas.
Līguma Nr. BMC2012/316 ietvaros tiek turpināti pētījumi par srtA enzīma un labāko atlasīto savienojumu mijiedarbības mehānismiem izmantojot KMR metodes, lai noskaidrotu perspektīvāko inhibitoro vielu saistības vietas uz enzīma virsmas, precīzi identificētu sortāzes aminoskābju atlikumus, ar kuriem saistās inhibitori, modelētu enzīma-inhibitoru kompleksu struktūras šķīdumos un veiktu enzīma-inhibitoru kompleksu trīsdimensionālās struktūras noteikšanu.
2012.g. novembris – 2013. g. februāris
Projekta 7.atskaites periodā (2012.g. novembris – 2013.g. februāris) ir pabeigta mazmolekulāro savienojumu bibliotēkas labāko atlasīto inhibitoro vielu šūnu augšanas inhibīcijas, toksicitātes un letālo devu (IC50/LD50) analīzes, kā arī noskaidrotas atlasīto savienojumu bakteriālās inhibīcijas koncentrācijas. Veiktajām pārbaudēm tika izmantotas HT-1080 cilvēka fibrosarkomas, MG22A cilvēka hepatomas un 3T3 peļu fibroblastu eikariotisko šūnu līnijas un S.aureus, S.epidermidis, L.reuteri un E.coli baktēriju celmi.
Izmantojot iepriekš iegūtos dažādo sortāzes ekspresijas formu enzimātiskās inhibēšanas datus, ir uzsākts darbs šo datu matemātiskās apstrādes un sistematizēšanas jomā, lai izvērtētu sortāzes inhibīcijas kinētiku, enzīma stabilitāti un citus inhibitoro vielu specifiskās iedarbības parametrus.
Paralēli sortāzes kristalizācijas testu pārbaudēm, ir uzsākta selenometionīna iezīmēta proteīna ekspresija un attīrīšana, lai uzsāktu plānotos enzīma-liganda rentgenstruktūras skaidrošanas un modelēšanas pētījumus.
Atskaites periodā ir pabeigts četrdesmit labāko atlasīto inhibitoro savienojumu un sortāzes enzīma mijiedarbības, saistības vietas noteikšanas, kā arī struktūras-aktivitātes likumsakarību analīzes pētījums, izmantojot kodolmagnētiskās rezonanses spektroskopiju. Analīzes rezultātā perspektīvākajiem atlasītajiem savienojumiem ir noteikta enzīma-inhibitora kompleksa trīsdimensionālā struktūra.
Iegūtie KMR dati ir atļāvuši uzsākt tālāk ieplānotos ķīmiskās sintēzes darbus jaunu atvasinājumu izveidē ar uzlabotām inhibitorās aktivitātes, antibakteriālo spēju un pazeminātu vielu toksicitātes īpašībām.
2013.g. marts – 2013. g. jūnijs
Projekta 8.atskaites periodā (2013.g. marts – 2013.g. jūnijs) ir iegūti vairāk kā 40 jauni mazmolekulāri savienojumi, kuru sintēzei izmantoja iepriekš veiktos KMR labāko atlasīto inhibitoro vielu analīzes pētījumus. Vienlaicīgi ar jaunsintezēto savienojumu ieguvi ir uzsākta kompleksa to inhibitoro un citu svarīgāko īpašību, ieskaitot toksicitāti, analīze, kuru pabeidzot, varēs izvēlēties potenciāli patentspējīgākos jaunus antibakteriālos līdzekļus.
Kā atsevišķs sintezēto preparātu antibakteriālo īpašību noskaidrošanas un izvērtēšanas pētījumu virziens (vielu toksiskums, farmakoloģiskais efekts, infekcijas attīstība, blaknes), kas šobrīd tiek aktīvi veikts, ir grampozitīvo baktēriju (S.aureus u.c.) infekcijas attīstības analīze dzīvnieku modelī (BALB/c līnijpeles).
Paralēli jauno inhibitoro savienojumu vispārējai analīzei, ir turpināts darbs ar dažādi izveidoto sortāzes formu enzimātiskās inhibēšanas datu apstrādi un sistematizēšanu, izvērtējot labāko inhibitoro vielu inhibīcijas kinētikas, iedarbības specifitātātes un enzīma stabilitātes nozīmi veiktajos testos. Tāpat ir turpināts darbs ar selenometionīna iezīmētas sortāzes kristalizēšanu un datu ieguvi, lai analizētu enzīma-liganda rentgenstruktūru un salīdzinātu abu izmantoto metožu, KMR spektroskopijas un rentgenkristalogrāfijas, inhibēšanas modeļus. Papildus, lai izvērtētu iepriekš iegūtos KMR struktūras modeļa datus labākajiem kandidātsavienojumiem, ir uzsākts darbs ar jaunsintezēto atvasinājumu un sortāzes kompleksu inhibitorās mijiedarbības modelēšanu un salīdzināšanu.
2013.g. jūlijs – 2013. g. septembris
Projekta 9.atskaites periodā (2013.g. jūlijs – 2013.g. septembris) tika turpinātas visas iesāktās jaunsintezēto vielu analogu, kopā vairāk nekā 40 mazmolekulāri savienojumi, inhibitoro īpašību un toksiskuma pārbaudes, lai galarezultātā noskaidrotu divus labākos savienojumus ar augstāko patentspēju. Paralēli jaunsintezēto inhibitoro savienojumu kompleksām pārbaudēm, tiek veikts darbs, lai skaidrotu, sistematizētu un analizētu projektā iegūtos dažādo testēto sortāzes formu enzimātiskās inhibēšanas un enzīma-inhibitora mijiedarbības datus. Tāpat turpinās iesāktais darbs ar selenometionīna iezīmētas sortāzes rentgenkristalogrāfijas datu analīzi, enzīma un inhibitora mijiedarbības struktūras noteikšanu un iegūto datu salīdzināšanu ar KMR modeli.
Otrs pētījumu virziens šajā atskaites periodā ir labāko jaunsintezēto antibakteriālo preparātu toksiskuma un farmakoloģiskā efekta noskaidrošana un īpašību raksturošana, ieskaitot infekcijas apkarošanas un infekcijas attīstības pārbaudes dzīvnieku modelī (peles BALB/c izmantojot S.aureus grampozitīvu baktēriju celmus.
2013.g. oktobris – 2013. g. decembris
Projekta 10.atskaites periodā (2013.g. oktobris – 2013.g. decembris) tika pabeigta visu jaunsintezēto savienojumu, kopā vairāk nekā 40 mazmolekulāras vielas, inhibitoro īpašību un toksiskuma pārbaudes, un tika noskaidroti divi labākie zāļu prototipi, kuriem sagatavoja patentu pieteikumus.
Paralēli jaunsintezēto inhibitoro savienojumu kompleksām pārbaudēm, tika sistematizēti un analizēti iegūtie dažādo sortāzes formu enzimātiskās inhibēšanas un enzīma-inhibitora mijiedarbības dati, kurus var izmantot tālākai detalizētai jaunu sortāzes inhibitoru raksturošanai. Izmantojot rentgenkristalogrāfijas datu analīzi, ir veikta enzīma un inhibitora mijiedarbības struktūras noteikšana un datu salīdzināšanu ar kodolmagnētiskās rezonanses modeli.
Labākajiem inhibitorajiem savienojumiem tika veikta antibakteriālo īpašību, toksiskuma un farmakoloģiskā efekta skaidrošana un raksturošana, izmantojot S.aureus un S.epidermides infekcijas pārbaudes dzīvnieku modelī (BALB/c peles), kā arī grampozitīvu baktēriju un eikariotisko šūnu kultūrās. Papildus, diviem perspektīvākajiem inhibitoru prototipiem ir izstrādātas optimizētas ķīmiskās sintēzes shēmas.