Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) darbības programmas “Izaugsme un nodarbinātība” 1.1.1. specifiskā atbalsta mērķa “Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā” 1.1.1.2. pasākums “Pēcdoktorantūras pētniecības atbalsts” ietvaros.

Projekta nosaukums: „Dabīgo galētājšūnu nozīme onkolītisko masalu vīrusu terapijas efektivitātē”

Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.2/VIAA/2/18/292

Projekta izpildes termiņš: 36 mēneši (2018. gada 1. oktobris – 2021. gada 30. septembris)

Projekta kopējais finansējums: 133 806,00 EUR

Projekta īstenotājs: Dr.rer.nat. Rūta Veinalde

Onkolītisko vīrusu (OV) terapija ienāk klīniskajā praksē kā multimodāls vēža terapijas veids. Viens no OV terapijas darbības mehānismiem ir pretvēža imūnatbildes stimulācija. Dabīgās galētājšūnas (NK šūnas) ir citotoksiski limfocīti, kas ir iesaistīti ļaundabīgu un vīrusu inficētu šūnu atpazīšanā un iznīcināšanā. NK šūnu nozīme OV terapijā vēl joprojām ir pretrunīga, dažiem pētījumiem norādot labvēlīgu, bet citiem nelabvēlīgu ietekmi uz OV terapijas efektivitāti. Šī projekta mērķis ir izpētīt NK šūnu molekulāros aktivācijas mehānismus onkolītisko masalu vīrusu (oMV) terapijas kontekstā, kā arī noskaidrot NK šūnu aktivācijas nozīmi oMV terapeitiskajā efektivitātē atkarībā no audzēja mikrovides, konkrēti, audzēja MHC-I statusa. Balstoties uz projekta gaitā iegūtajiem rezultātiem, tiks izstrādātas un pārbaudītas stratēģijas racionālai NK šūnu modulācijai oMV terapijas laikā ar mērķi izveidot kombināciju terapijas stratēģijas ar palielinātu terapeitisko efektivitāti.

Informācija publicēta 01.10.2018.

Projekta progress:

2018. gada 1. oktobris – 2018. gada 31. decembris

Projekta sākuma fāzē BMC pieejamā primāro melanomas šūnu līniju kolekcija (11 šūnu līnijas) ir tikusi validēta uz melanomai specifisku marķieru ekspresiju mRNS līmenī ar RT-PCR metodi. Validētajām šūnu līnijām tikusi novērtēta onkolītiskā masalu vīrusa (oMV) permisivitāte izmantojot fluorescences mikroskopiju. Tajās pašās melanomas šūnu līnijās ar kolorimetrisku šūnu dzīvotspējas testu novērtēta oMV citotoksicitāte. Balstoties uz šiem rezultātiem, divas no melanomas šūnu līnijām izvēlētas turpmākajiem eksperimentiem. Izstrādāti un pārbaudīti arī protokoli cilvēka dabīgo galētājšūnu (NK šūnu) izdalīšanai no asinīm un šo šūnu kultivēšanai in vitro. Ar laktātdehidrogenāzes citotoksicitātes testu parādīts, ka divas iepriekš izvēlētās melanomas šūnu līnijas ir jutīgas pret ar IL-2 aktivētu NK šūnu citotoksisko aktivitāti in vitro. Vēl BMC uzsākta laboratorijas tīrības pakāpes oMV produkcija, kas nepieciešami turpmākajiem eksperimentiem.

Informācija publicēta 28.12.2018.

Projekta progress:

2019. gada 1. janvāris – 2019. gada 31. marts

Šajā projekta īstenošanas fāzē ir pabeigta laboratorijas tīrības pakāpes onkolītisko masalu vīrusu (oMV) produkcija BMC. Ir ticis optimizēts protokols dabīgo galētājšūnu (NK šūnu) izolēšanai no cilvēka perifēro asiņu mononukleārajām šūnām. Noteikts, ka NK šūnu izdalīšana, kas balstās uz negatīvo selekciju izmantojot magnētiskās lodītes, ir vispiemērotākā turpmāk plānotajiem eksperimentiem. Veikti eksperimenti, lai salīdzinātu NK šūnu citotoksisko aktivitāti pret ar oMV inficētām un neinficētām primārās melanomas šūnu līnijām (divas dažādas šūnu līnijas). Vienā no šīm šūnu līnijām novērota tendence paaugstinātai NK šūnu citotoksicitātei pret inficētām šūnām, kamēr otrā šūnu līnijā šāds efekts nav novērots. Lai apstiprinātu šos rezultātus, izstrādāts protokols NK šūnu citotoksicitātes mērīšanai reālajā laikā izmantojot digitālu šūnu mikroskopēšanas sistēmu.

Tāpat veikti eksperimenti, lai noteiktu oMV infekcijas tiešo ietekmi uz NK šūnu aktivācijas statusu. Rezultāti rāda, ka paaugstinātas oMV koncentrācijas klātbūtnē nedaudz pieaug agrīnā aktivācijas marķiera CD69 ekspresija uz NK šūnu virsmas.

Visbeidzot, sadarbībā ar Imunoloģijas laboratoriju Lietuvas Nacionālājā Vēža Institūtā Viļņā notiek darbs pie protokolu izstrādes oMV infekcijas ietekmes novērtēšanai uz dendrītisko šūnu un NK šūnu mijiedarbību.

Informācija publicēta 29.03.2019.

Projekta progress:

2019. gada 1. aprīlis – 2019. gada 30. jūnijs

Izmantojot Cytation 5 šūnu vizualizēšanas iekārtu, izveidots un validēts protokols NK šūnu citotoksicitātes mērījumiem reālajā laikā. Izmantojot izveidoto reālā laika citotoksicitātes metodi, pabeigti eksperimenti, lai salīdzinātu NK šūnu citotoksicitāti pret ar oMV inficētām un neinficētām melanomas šūnu līnijām. Iegūtie rezultāti rāda, ka aktivētas NK šūnas strauji iznīcina melanomas šūnas in vitro, sasniedzot līdz 80% specifisku mērķa šūnu līzi četras stundas pēc eksperimenta sākuma. Tomēr eksperimentos nav novērotas statistiski ticamas atšķirības NK šūnu citotoksicitātes efektivitātē pret ar oMV inficētām un neinficētām melanomas šūnām. Reālā laika citotoksicitātes protokols turpmāk tiks izmantots, lai noteiktu, vai NK šūnu inkubācija ar oMV ietekmē arī NK šūnu citotoksiskās īpašības.

Šajā projekta īstenošanas fāzē arī veikti piloteksperimenti, lai pārbaudītu protokolu dendrītisko šūnu (DŠ) iegūšanai no monocītu diferenciācijas in vitro. Izmanotojot šo protokolu, tālākajā darbā tiks novērtēta oMV infekcijas ietekme uz DŠ un NK šūnu savstarpējo mijiedarbību. Eksperimenti ar dendrītiskajām šūnām tiek veikti sadarbībā ar Imunoloģijas laboratoriju Lietuvas Nacionālājā Vēža Institūtā Viļņā.

Informācija publicēta 28.06.2019.

Projekta progress:

2019. gada 1. jūlijs – 2019. gada 30. septembris

Šajā projekta īstenošanas fāzē ir veikti eksperimenti, lai novērtētu oMV infekcijas ietekmi uz NK šūnu un dendrītisko šūnu (DŠ) mijiedarbību. Šie eksperimenti tiek veikti sadarbībā ar Imunoloģijas Laboratoriju Lietuvas Nacionālajā Vēža Izpētes Centrā, Viļņā. Veikto eksperimentu plūsmas citometrijas rezultāti parādījuši, ka pēc infekcijas ar oMV uz DŠ virsmas tiek augstāk ekspresēti DŠ nobriešanas marķieri. Patlaban šie eksperimenti turpinās un notiek darbs, lai NK un DŠ kokultūrās novērtētu oMV infekcijas ietekmi uz NK šūnu aktivācijas statusu.

Tāpat šajā projekta fāzē ir uzsākts darbs pie dzīvnieku eksperimentu plānošanas, lai novērtētu NK šūnu lomu oMV terapijas efektivitātē atkarībā no audzēja Galvenā audu saderības kompleksa I (MHC-I) statusa. Plānotie dzīvnieku eksperimenti tiks veikti izmantojot transplantējamus peļu audzēju modeļus. Ir sagatavots izmēģinājuma projekts par dzīvnieku izmantošanu procedūrās, kas iesniegts atbilstības vērtēšanai Pārtikas un veterinārajā dienestā. 

Informācija publicēta 30.09.2019.

Projekta progress:

2019. gada 1. oktobris – 2019. gada 31. decembris

Šajā projekta īstenošanas fāzē ir izveidots protokols, lai pētītu ar onkolītisko masalu vīrusu (oMV) inficētu dendrītisko šūnu (DŠ) kokultūras ar dabīgajām galētājšūnām (NK). Iegūtie rezultāti parādījuši, ka kokultūrās ar oMV inficētām DŠ, uz NK šūnu virsmas paaugstinās agrīnā aktivācijas marķiera CD69 kā arī degranulācijas marķiera CD107a ekspresija. Noskaidrots, ka paaugstinātā aktivācijas marķieru ekspresija uz NK šūnu virsmas veiktajos kokultūru eksperimentos ir atkarīga no oMV replikācijas, jo kokultūrās ar DŠ, kuras apstrādātas ar UV gaismā inaktivētiem oMV, netika novērota paaugstināta minēto aktivācijas marķieru ekspresija uz NK šūnām. Tāpat rezultāti parādījuši arī, ka nav nepieciešams tiešs kontakts starp ar oMV inficētajām DŠ un NK šūnām, lai pieaugtu aktivācijas marķieru ekspresija uz NK šūnām. Tas norāda, ka par novēroto NK šūnu aktivāciju, visticamāk, galvenokārt ir atbildīgi no DŠ izdalīti šķīstoši faktori. Turpmākajā projekta gaitā tiks veikti eksperimenti, lai detalizēti pētītu NK šūnu aktivācijas mehānismus kokultūrās ar oMV inficētām DŠ.

Tāpat, šajā projekta īstenošanas fāzē ir pabeigts darbs pie turpmāk plānoto dzīvnieku eksperimentu protokoliem, kā arī ir saņemta atļauja no Pārtikas un veterinārā dienesta visu turpmāk plānoto dzīvnieku eksperimentu veikšanai.

Informācija publicēta 30.12.2019.

Projekta progress

2020. gada 1. janvāris – 2020. gada 31. marts

Šajā projekta īstenošanas fāzē turpināti eksperimenti ar dabīgo galētājšūnu (NK) un dendrītisko šūnu (DŠ) kokultūrām. Proti, veikti eksperimentu atkārtojumi ar šūnām, kas iegūtas no kopumā pieciem dažādiem donoriem. Iepriekš novērotā NK šūnu aktivācija kokultūrās ar oMV inficētām DŠ pierādīta eksperimentos ar visiem analizētajiem donoriem. Visu eksperimentu rezultāti arī norāda, ka par NK šūnu aktivāciju kokultūru sistēmā atbildīgi galvenokārt šķīstoši faktori. Lai noskaidrotu faktorus, kas iesaistīti NK šūnu aktivācijā kokultūru sistēmā, analizēta 13 dažādu pretvīrusu atbildē iesaistītu citokīnu koncentrācija barotņu paraugos, kas ievākti iepriekš veiktajos eksperimentos. Rezultāti parāda, ka ar oMV inficēto DŠ barotnēs pieaug IFN-a2 un IFN-l1 koncentrācija, kā arī iekaisuma reakcijās iesaistīto citokīnu IL-6, TNF-a un IL-10 koncentrācija. Ļoti ievērojama koncentrācijas paaugstināšanās novērota ar hemokīnam CXCL10.

Šajā projekta īstenošanas fāzē arī turpinās darbs pie projekta daļas, kurā tiks pētīts, kā audzējos mainās NK šūnu loma oMV terapijas efektivitātē atkarībā no galvenā audu saderības kompleksa I (MHC-I) ekspresijas. Ar CRISPR-Cas9 genoma labošanas metodes palīdzību ir izveidota MHC-I negatīva peļu kolorektālās adenokarcinomas MC38cea šūnu līnija (MC38cea-MHC-I^KO), kas tiks izmantota, lai izveidotu eksperimentiem nepieciešamo MHC-I negatīvo audzēja modeli imūnkompetentajās C57BL/6 pelēs. Tāpat arī izveidots dzīvnieku eksperimentiem nepieciešamā oMV genoms (NSe Hbl-anti-CEA), kurā oMV hemaglutinīnam pievienots variablais fragments no vienas ķēdes antivielas pret CEA antigēnu, lai iegūtu vīrusu, kas spēj inficēt peļu MC38cea šūnas. Saražoti laboratorijas tīrības pakāpes NSe Hbl-anti-CEA vīrusi dzīvnieku eksperimentiem nepieciešamajā daudzumā.

Visbeidzot, notiek darbs pie manuskripta sagatavošanas publikācijai sadarbībā ar kolēģiem Nacionālajā Vēža Slimību Centrā Heidelbergā, Vācijā.

Informācija publicēta 31.03.2020.

Projekta progress

2020. gada 1. aprīlis – 2020. gada 8. jūnijs

Šajā projekta īstenošanas fāzē veikts eksperiments, lai noskaidrotu ar oMV inficētu DŠ kokultivēto NK šūnu funkcionalitātes izmaiņas. Proti, ar reālā laika citotoksicitātes testa palīdzību parādīts, ka NK šūnas no kokultūrām ar inficētām DŠ ātrāk nogalina primāras melanomas šūnas in vitro.

Šajā projekta īstenošanas fāzē turpināts darbs pie iepriekš izveidotās MC38cea-MHC-I negatīvās (MC38cea-MHC-I-KO) šūnu līnijas raksturošanas. Proti, salīdzināta masalu vīrusa replikācija un citotoksicitāte jaunajā MC38cea-MHC-I-KO šūnu līnijā un parentālajā MC38cea šūnu līnijā.

Informācija publicēta 08.06.2020.