Projekta nosaukums: Nanodaļiņu pārnese caur endotēlija barjeru (Nanoparticle Transfer Through Endothelial Barrier)
Akronīms: NanoTENDO
Uzsaukums: M-ERA.NET Call 2018
Līguma numurs: Nr. 1.1.1.5/ERANET/19/07
Īstenošanas termiņš: 2019. gada 1. oktobris – 2023. gada 31. augusts
Koordinators: University of Lodz
Projekta partneri:
University of Alcala, Faculty of Sciences, Department of Organic and Inorganic Chemistry
Riga Stradiņš University
Latvian Biomedical Research and Study Centre
Projekta vadītājs: Dr.biol., Juris Jansons
Kopējais projekta finansējums: 170 000.00 EUR
Kopsavilkums
Vairākas ar smadzenēm saistītas slimības (multiplā skleroze, Alcheimera slimība (AS), insults utt.) netiek ārstētas efektīvi, jo terapeitiskās molekulas nevar šķērsot endotēlija barjeru, kas ir svarīga daļa barjerām starp asinīm un smadzenēm. Dažas nanodaļiņas (ND) – zelta ND, dendrimeri, dendroni – ir daudzsološs jauns līdzeklis, lai šķērsotu endotēlija un asins-smadzeņu barjeras un piegādātu smadzenēs bioloģiski aktīvos savienojumus, tādus kā zāles un imūnterapijas līdzekļus. Pašlaik mēs joprojām nezinām, kādām īpašībām ir jābūt daļiņām, lai tās varētu šķērsot barjeras, līdz ar to mēs nevaram tās mērķtiecīgi projektēt. Visi literatūrā aprakstītie ND tika atlasīti empīriski pēc vairāku kandidātu pārbaudes. Tāpēc šī projekta galvenais mērķis ir noskaidrot mehānismus, ar kuriem daudzsološākie ND – zelta ND, dendrimeri, dendroni un to kompleksi ar zālēm tiek pārnesti caur endotēlija barjeru.
In vitro eksperimentos tiks izmantots endotēlija barjeras modelis: primārās cilvēka aortas endotēlija šūnas. Primāro šūnu izolēšana saskaras ar vairākām grūtībām, tostarp ar reaģentu un procedūru dažādību, un ar piekļuvi atbilstoši ētiskiem noteikumiem iegūtiem donoru audiem, tāpēc mēs nolēmām izmantot komerciāli pieejamos materiālus. ND pārneses mehānismus (uzņemšanu, citotoksicitāti un izplūdi) un šūnu funkcionālo stāvokli (aktīvo/pasīvo transportu, proliferāciju, morfoloģiju) pārbaudīs, ņemot vērā tukšo un ar zālēm vai imūnterapijas līdzekļiem pielādēto ND lielumu, lādiņu, hidrofobitāti un elastību. Tie paši mehānismi tiks analizēti šūnu stresa apstākļos, izmantojot oksidatīvo stresu un skābu vidi (kas saistīta ar insultu), un amiloidbeta peptīdu klātbūtnē (saistībā ar AS). Iegūtie dati: (i) izskaidros ND pārnešanas mehānismus caur endoteliālo barjeru atkarībā no tās rakstura, galvenajām funkcionālajām grupām un pievienotajiem medikamentiem un/vai imunoterapeitiskiem līdzekļiem, un (ii) raksturos endotēlija barjera funkcionēšanu ND un tās kompleksu ar zālēm/imūnterapijas līdzekļiem pārnešanas laikā fizioloģiskos un patoloģiskos apstākļos. Rezultāti nodrošinās pamatu sistemātiskai ND derības pārbaudei aktīvo vielu piegādei smadzenēs.
In vivo eksperimentos izmantos AS un smadzeņu išēmijas peles modeļus, lai izpētītu terapeitisko potenciālu ND kompleksiem ar zālēm un imūnterapeitiskiem nukleīnskābju preparātiem. Pētījumu objekti būs 2-4 dažādu veidu zelta ND, jaunie sintezētie 1.-4. paaudzes dendrimeri un to atbilstošie dendroni; un ND kompleksi ar zālēm (laquinimod), uz endotēlija šūnām mērķētiem proteīniem (transferrīnu, kviešu dīgļu aglutinīnu) vai īsas ķēdes nukleīnskābes (divpavedienu siRNS un imūnmodulējošas īsas divpavedienu DNS un vienpavedienu RNS). Kompleksi tiks iezīmēti ar fluorescējošām vielām, lai sekotu to pārnešanai. Pētījumu priekšmeti būs endotēlija barjeras modelis (komerciāli pieejamās primārās cilvēka aortas endotēlija šūnas) un Alcheimera slimības un smadzeņu išēmijas peļu modeli in vivo eksperimentos. Primārās šūnas tiek izolētas tieši no donora audiem un tādējādi saglabā audu īpašības, kas ir tuvās in vivo apstākļiem.
Projekta uzdevumi ir:
(1) izpētīt ND iekļūšanu un izplūdi caur endotēlija barjeru un tās citotoksicitāti, izmantojot molekulārās un šūnu bioloģijas metodes; (2) novērtēt endotēlija barjeras šūnu funkcionālo stāvokli ND un to kompleksu klātbūtnē; (3) atkārtot (1) un (2) endotēlija barjeras stresa apstākļos, ko izraisa oksidatīvs stress un paskābināšanās (kas saistīta ar smadzeņu išēmiju) un amiloidbeta peptīdu klātbūtne (kas saistīti ar Alcheimera slimību); (4) izveidot smadzeņu išēmijas un AS peles modeļus; (5) apstiprināt iepriekš testēto zāļu / nukleīnskābju ND kompleksu terapeitisko potenciālu in vivo sistēmā.
Informācija publicēta 01.10.2019.
Projekta progress:
- gada 1. oktobris- 2019. gada 31. decembris
Pārskata periodā ir saskaņots un parakstīts Projekta konsorcija līgums. Notiek darbi pie mājās lapas izstrādes, tiek vākta nepieciešamā informācija no konsorcija partneriem.
Informācija publicēta 31.12.2019.
Projekta progress:
- gada 1. janvāris- 2020. gada 31. marts
Tiek gatavots pieteikums pārtikas un veterinārais dienesta ētikas komisijai izmēģinājuma projekta atļaujas dzīvnieku izmantošanai projektā ieplānotos eksperimentos. Turpinās darbs pie mājaslapas izstrādes.
Informācija publicēta 31.03.2020.
Projekta progress:
- gada 1. aprīlis- 2020. gada 30. jūnijs
Pārskata periodā ir pabeigta projekta interneta mājaslapas izstrāde. http://nanotendo.pl/, tā tiek papildināta ar informāciju no konsorcija partneriem. Konsultējoties ar konsorcija partneriem, tika izstrādāts eksperimentu plāns, ņemot vērā situāciju ar Covid19 pandēmiju un pieejamo infrastruktūru. Tika analizēti pētījumu ētiskie aspekti.
Informācija publicēta 30.06.2020.
Projekta progress:
- gada 1. jūlijs- 2020. gada 30. septembris
Pārskata periodā Projekta teorētiskā bāze tika papildināta ar informāciju no aktuālām zinātniskām publikācijām par išēmiskā insulta un Alcheimera slimības terapijas metodēm, ir izvērtētas iespējas testēšanai peļu modeļos izvelēto terapijas līdzekļu kompleksā ar nanodaļiņām (dendrimeriem).
Informācija publicēta 30.09.2020.
Projekta progress:
- gada 1. oktobris- 2020. gada 31. decembris
Pārskata periodā tika veikti dendrimēru nanodaļiņu un terapijas līdzekļu kompleksu izveidošanas eksperimenti un iegūto kompleksu stabilitātes un citu īpašību testēšanā in vitro eksperimentos. Balstoties uz rezultātiem, par Alcheimera slimības ārstēšanas līdzekli tika izvelēts siRNA preparāts, kas specifiski izsauc ar slimības attīstību saistīto MAPT gēnu noklusēšanu.
Informācija publicēta 31.12.2020.
Projekta progress:
- gada 1. janvāris- 2021. gada 31. marts
Pārskata periodā Ir izstrādāta stratēģijā dendrimēru un pārnēsājamo vielu iezīmēšanai ar fluorescentiem marķieriem, kas ļauj pētīt ievadīto zaļu izplatīšanu organismā un spēju šķērsot asins-smadzeņu barjeru dzīvnieku eksperimentos. Sakara ar Covi19 situāciju Spānijā un Polijā eksperimentu grafiks tika būtiski kavēts, līdz ar to projekta partneri vienojas par projekta izpildes termiņa pagarināšanu.
Informācija publicēta 31.03.2021.
Projekta progress:
- gada 1. aprīlis- 2021. gada 30. jūnijs
Pārskata periodā tika veikti eksperimenti lai optimizētu dendrimēru un iezīmēto siRNA preparātu kompleksu gan pie glabāšanas, gan pie transportēšanas gan fizioloģiskajos apstākļos. Ir apstiprināta projekta izpildes termiņa pagarināšana, konsorcija līgums un darbu plāns tika grozīti saskaņā ar jauno projektā ievešanas grafiku.
Informācija publicēta 30.06.2021.
Projekta progress:
- gada 1. jūlijs- 2021. gada 30. septembris
Veicot dendrimēru un iezīmēto siRNA preparātu kompleksu stabilitātes pētīšanu pie transportēšanas dažādos apstākļos, tika secināts kā iegūtie kompleksi ir jutīgi pret temperatūras svārstībām. Līdz ar to tik pieņemts lēmums transportēt dendrimerus sausa veidā un kompleksus ar siRNA gatavot Latvijā tieši pirms in vivo eksperimentu veikšanas. Tiek strādāts pie dendrimēru un iezīmēto siRNA kompleksu pagatavošanas metodes pārneses no Polijas komandas Latvijas komandai.
Informācija publicēta 30.09.2021.
Projekta progress:
- gada 1. oktobris – 2021. gada 31. decembris
Pārskata periodā tika strādāts pie dendrimēru un iezīmēto siRNA kompleksu pagatavošanas metodes apgūšanas. No Polijas komandas uz Latviju tika pārnests preparātu pagatavošanas protokols kā arī nepieciešams izejvielas. Iegūto kompleksu īpašības un stabilitāte tika pārbaudītās ar fizikālās ķīmijas metodēm. Paralēli tika turpināts darbs gatavojot pieteikumu pārtikas un veterinārais dienesta ētikas komisijai izmēģinājuma projekta atļaujas dzīvnieku izmantošanai projektā ieplānotos eksperimentos.
Informācija publicēta 30.12.2021.
Projekta progress:
- gada 1. janvāris – 2022. gada 31. marts
Pārskata periodā tika turpināts darbs pie dendrimēru un iezīmēto siRNA kompleksu pagatavošanas metodes apgūšanas. Iegūto kompleksu bioloģiskās īpašības (spējā efektīvi šķērsot šūnu membrānu) tika pārbadītas šūnu kultūras eksperimentos.
Paralēli tika turpināts darbs gatavojot pieteikumu pārtikas un veterinārais dienesta ētikas komisijai izmēģinājuma projekta atļaujas dzīvnieku izmantošanai projektā ieplānotos eksperimentos.
Informācija publicēta 31.03.2022.
Projekta progress
- gada 1. aprīlis – 2022. gada 30. jūnijs
Pārskata periodā tika veikts darbs pie peļu modeļu izveidošanas pētāmo dendrimēru un terapijas preparātu efektivitātes pārbaudei. Tika izvelēts Alcheimera slimības modelis – transgēnās peles ar ievesto cilvēka APOE4 gēnu. Tika izvelts išēmiskā smadzeņu insulta modelis – vidējās cerebrālās artērijas ķirurģiskā oklūzija pelēs. Tika izstrādāts protokols lai noteiktu dendrimēru un iezīmēto siRNA kompleksu uzsūkšanos, izplatīšanos un izvietošanos peļu organismā. Tika turpināts darbs gatavojot pieteikumu pārtikas un veterinārais dienesta ētikas komisijai izmēģinājuma projekta atļaujas dzīvnieku izmantošanai projektā ieplānotos eksperimentos.
Informācija publicēta 30.06.2022.
Projekta progress:
- gada 1. jūlijs- 2022. gada 30. septembris
Pārskata periodā tika veikts darbs pie peļu modeļu izstrādes, lai pārbaudītu dendrimeru un terapeitisko līdzekļu kompleksu efektivitāti. Smadzeņu, aknu, nieru, plaušu un sirds peļu audi, kas satur iezīmētus dendrimerus, tika iegūti un nosūtīti RSU patologiem bioizplatīšanas pētījumiem.
Alcheimera slimības modelim no dažāda veida ģenētiski modificētām pelēm, kas ekspresē APOE4 gēnu, tika izvēlēta APOE4 KI līnija. Eksperimenta plānošanai tika pētīts dzīvnieku genotips un fenotips, lai izvēlētos optimālo dzīvnieku vecumu ārstēšanas efektivitātes noteikšanai. Išēmiskā insulta modelim tika pētītas fenotipiskās izmaiņas, kuras var noteikt ar audu imūnhistoloģijas analizi. Tika turpināts darbs gatavojot pieteikumu pārtikas un veterinārais dienesta ētikas komisijai izmēģinājuma projekta atļaujas dzīvnieku izmantošanai projektā ieplānotos eksperimentos.
Informācija publicēta 30.09.2022.
Projekta progress
- gada 1. oktobris – 2022. gada 31. decembris
Konsultējoties ar projekta koordinatoru, tika lemts par Laquinimod zāles kompleksā ar dendrimēriem izmantošanu išēmiskā trieka seku ārstēšanai peļu modelī. Karbosilāna un ar polimēru pārklātās zelta dendrimēru nanodaļiņas tika izvelētas par ārstniecības līdzekļa nesējiem. Tika precizētas nepieciešama peļu modeļa īpašības. Projekta teorētiskā bāze tika papildināta ar informāciju no aktuālām zinātniskām publikācijām par nanodaļiņu izmantošanu endotēija asins — smadzeņu barjeras pārvarēšanai, ņemot vērā laboratorijas dzīvnieku modeļu specifiku. Tika turpināts darbs gatavojot pieteikumu pārtikas un veterinārais dienesta ētikas komisijai izmēģinājuma projekta atļaujas dzīvnieku izmantošanai projektā ieplānotos eksperimentos.
Informācija publicēta 30.12.2022.
Projekta progress:
- gada 1. janvāris – 2023. gada 31. marts
Pēc papildus konsultācijām ar projekta koordinatoru, par terapijas līdzeklī smadzenes išēmiskā insulta ārstēšanai tika izvelētā siRNS kas bloķē metalloproteinases MMP12 sintēzi bojātos audos un līdz ar to samazina iekaisuma negatīvo efektu. Tika izstrādāta eksperimentu shēma, kas ietilpst gan audu histopatoloģiskos un bioķimiskus testus gan eksperimentālo dzīvnieku uzvedības testus terapijas efekta noteikšanai. Pelēm ar mākslīgi izsaukto smadzenes išēmiju un veseliem dzīvniekiem ir plānots ievadīt iezīmēto MMP12 siRNS kompleksā ar divu veidu nanodaļiņām – karbosilāna dendrimēriem un dendrimēriem ar zelta serdeni. Tika izveidots išēmiskā smadzeņu insulta modelis – vidējās cerebrālās artērijas ķirurģiskā oklūzija pelēs. Ir izstrādāts smadzeņu audu savākšanas un apstrādes protokols turpmākām histoloģiskām analīzēm. Izmēģinājuma projekta pieteikums atļaujai dzīvnieku izmantošanai projektā ieplānotos eksperimentos ir sagatavots un iesniegts pārtikas un veterinārais dienesta ētikas komisijai.
Informācija publicēta 31.03.2023.
Projekta progress
- gada 1. aprīlis – 2023. gada 30. jūnijs
Tika veikti eksperimenti ar ishēmiskā trieka peļu modeli. Pelēm ar ķirurģiski izsaukto smadzenes išēmiju tika intravenozi ievesta iezīmētā MMP12 siRNS kompleksā ar divu veidu nanodaļiņām – karbosilāna dendrimēriem un dendrimēriem ar zelta serdeni. Lai novērtētu ievadīto vielu terapeitisko efektu dzīvniekiem tika veikti uzvedības testi, kas raksturo lokomotoru sistēmas funkcijas. Dzīvnieku audu paraugi ir savākti un iedoti RSU Patoloģijas katedras pētniekiem histoloģisko analīžu veikšanai, lai noteiktu ievadīto vielu iedarbību un to izplatīšanas dzīvnieku orgānos. Iegūtie eksperimentu rezultāti tiek analizēti.
No pārtikas un veterinārais dienesta ētikas komisijas ir dabūta atļauja dzīvnieku izmantošanai projektā ieplānotos eksperimentos ar Alcheimera slimības peļu modeli.
Informācija publicēta 30.06.2023.
Projekta progress:
- gada 1. jūlijs – 2023. gada 31. augusts
Tika veikti eksperimenti ar Alcheimera slimības peļu modeli. Eksperimentos tika izmantoti ģenētiski modificētas pelēs ar ievadīto cilvēka APOE4 gēnu, kas paaugstina Alcheimera slimības attīstīšanās risku. Pelēm tika intravenozi ievesta iezīmētā APOE4 siRNS kompleksā ar divu veidu nanodaļiņām – karbosilāna dendrimēriem un dendrimēriem ar zelta serdeni. Izmantojot IVIS attēlveidošanas tehniku tika noteikta ievadītas vielas izplatībā dzīvnieku orgānos. Lai novērtētu ievadīto vielu terapeitisko efektu dzīvniekiem tika veikti uzvedības testi, kas raksturo kognitīvās funkcijas. Dzīvnieku audu paraugi ir savākti histoloģisko analīžu veikšanai un APOE4 gēna ekspresijas līmeņa noteikšanai.
Informācija publicēta 31.08.2023.