Projekta nosaukums: „Orfāno ar G-proteīnu saistīto receptoru, peptīdu dabas ligandu skrīnēšanas sistēmas izstrāde”
Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 1.1.1.1. pasākuma “Praktiskas ievirzes pētījumi” 1. kārtas ietvaros.
Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.1/16/A/055
Projekta izpildes termiņš: 2017. gada 1. janvāris – 2019. gada 31. decembris
Projekta kopējais finansējums: 285 245,84 EUR
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr. biol. D. Fridmanis
Ar G-proteīnu saistītie receptori (GPCR) ir lielākā membrānas receptoru saime. To galvenā funkcija ir signālu pārnese cauri membrānai. Visi GPCR-i sastāv no septiņiem transmembrānas domēniem un, sasitot ligandus, aktivē heterotrimeros G proteīnus. Tie ir vieni no visrūpīgāk pētītajiem medikamentu mērķiem farmācijas industrijā un 36% no tirgū pieejamajiem medikamentiem iedarbojas, saistoties ar tiem. Tomēr vairāk nekā 90 cilvēka GPCRu vēl arvien nav noskaidrots dabīgais ligands, tādeļ tos dēvē par orfāniem receptoriem. Daudziem no tiem farmakoloģiskā nozīme tika izvērtēta peļu modeļos, pielietojot gēna izslēgšanu un tika secināts, ka orfānie receptori ir būtiski organisma darbības regulācijā, un, to ligandu atrašana varētu radīt jaunus medikamentus. Par farmācijas industrijai nozīmīgiem var tikt uzskatīti arī daudzi komerciāli audzēto organismu orfānie receptori. Tādeļ arī to ligandu atklāšana būtu ekonomiski pamatota un izdevīga. Daļā gadījumu šie citu sugu ligandi varētu būt funkcionāli aktīvi arī zīdītājos un varētu kalpot par bāzi jaunu medikamentu izstrādē.
Šī projekta mērķis ir izstrādāt vienkāršu un efektīvu uz rauga S.cerevisiae balstītu peptīdu dabas GPCR ligandu atklāšanas sistēmas prototipu, ka arī pārbaudīt to praksē, nosakot ascidijas oreksina receptoram līdzīga receptora ligandu un izvērtējot jaunatklātā liganda ietekmi uz cilvēka Oreksina receptoriem.
Šī pētniecības projekta realizācija sniegs ieguldījumu Latvijas viedas specializācijas stratēģijas noteiktās jomās – biofarmācijā un biotehnoloģijas attīstība, jo izstrādājamajam prototipam piemīt potenciāls veicināt jaunu preparātu izstrādi tādejādi, sniedzot ieguldījumu Latvijas farmācijas industrijas attīstībā, un attiecīgi, uzlabojot Latvijas tautsaimniecības konkurētspēju.
Informācija publicēta: 02.01.2017.
Projekta progress
2017. gada 1. janvāris – 2017. gada 31. marts
Eksperimentālā izstrāde
Saskaņā ar plānu, projekta izpildes pirmie trīs mēneši tika veltīti dubultās ekspresijas plazmīdas izveidei. Tā kā mūsu rīcībā esošās ekspresijas plazmīdas: p426GPD un p426TEF bija faktiski identiskas tad, šo darbu ietvaros, ar mērķi padarīt ekspresijas lokusu multiklonālos rajonus atšķirīgus un savstarpēji savietojamus, tie tika modificēti tā, lai katrs saturētu tikai divus – klonēšanai nepieciešamus restrikcijas saitus. Tālākajā darbu gaitā, pēc iegūto plazmīdu sekvences atbilstības pārbaudes, TEF promoteru saturošais lokus no p426TEF plazmīdas tika pārklonēts uz p426GPD plazmīdu. Uz doto brīdi norit darbi pie iegūtās konstrukcijas sekvences atbilstības pārbaudes.
Informācija publicēta: 31.03.2017.
Projekta progress
2017. gada 1. aprīlis – 2017. gada 30. jūnijs
Eksperimentālā izstrāde
Šajā projekta posmā TEF promoteru saturošās plazmīdas gēna ekspresijai nozīmīgais funkcionālais rajons tika pārcelts uz GDP promoteru saturošo plazmīdu un iegūtajā dubultās ekpresijas plazmīdā tika ievietoti attiecīgi MC4R un a-MSH kodēšošie gēni. Pēc šīs plazmīdu ieguves tajā ievietotās kodējošās sekvences tika nosekvencētas, lai pārliecinātos par iegūtā rezultāta atbilstību plānotajam. Turpmākajā darba gaitā tika uzsākti darbi, kas ietvēra iegūtās dubultās ekspresijas plazmīdas funkcionālo pārbaudi.
Informācija publicēta: 30.06.2017.
Projekta progress
2017. gada 1. jūlijs – 2017. gada 30. septembris
Eksperimentālā izstrāde
Šajā projekta posmā tika uzsākti darbi pie iepriekš izveidotās dubultās ekspresijas plazmīdas funkcionālo pārbaudi. To ietvaros izveidotā plazmīda un kontroles plazmīdas tika ietransformētas humanizētā S.cerevisiae rauga celma MMY28 šūnās, kas savukārt tika izsētas uz selektīvās barotnes saturošām petri platēm, kas atsevišķos gadījumos bija papildinātas ar MC4R ligandu – a-MSH. Iegūtie rezultāti nebija viennozīmīgi tādēļ nākamajos posmos tiks atkārtoti.
Informācija publicēta: 29.09.2017.
Projekta progress
2017. gada 1. oktobris – 2017. gada 31. decembris
Eksperimentālā izstrāde
Šajā projekta posmā tika turpināti darbi pie iepriekš izveidotās dubultās ekspresijas plazmīdas funkcionālās pārbaudes. To ietvaros attiecīgās plazmīdas tika atkārtoti transformētas S.cerevisiae rauga MMY28 celma šūnās, kas tālāk tika izsētas uz selektīvu barotni saturošām petri-platēm, kuru sastāvs atsevišķos gadījumos tika papildinātas ar a-MSH. Tā kā iegūtie rezultāti atkārtoti bija neviennozīmīgi, tad tika nolemts plazmīdas darbību pārbaudīt Western-Blot metodes ietvaros pielietojot a‑MSH specifisku antivielu. Paralēli, lai nekavētu projekta izpildi, tika izstrādāts eksperimentu plāns, kura ietvaros divas atsevišķas ekspresijas plazmīdas tiks secīgi transformētas S.cerevisiae rauga MMY28 celma šūnās.
Informācija publicēta: 02.01.2018.
Projekta progress:
2018. gada 1. janvāris – 2018. gada 31. marts
Eksperimentālā izstrāde
Šajā projekta posmā Eksperimentālās izstrādes aktivitātes ietvaros tika veikti eksperimenti kuru ietvaros ar Western-Blot metodes palīdzību pielietojot a-MSH specifisku antivielu tika novērtēta iepriekš izstrādāto plazmīdu darbība. Iegūtie rezultāti apstiprināja, ka eksperimentu gaitā a-MSH tiek ekspresēts, tomēr, ņemot vērā vājo signālu, tā sekrēcijas apjoms varētu nebūt pietiekams, lai efektīvi aktivētu līdz-ekspresēto MC4R, kas arī izskaidro iepriekš iegūtos – neviennozīmīgos rezultātus. Lai rastu risinājumu šai problēmai, tika veikta padziļināta literatūras analīze. Tās rezultātā tika secināts, ka starp sekretējamo peptīdu un sekrēcijas signālu ir nepieciešams ievietot savienotājpeptīdu. Uz doto brīdi ir uzsākta savienotājpeptīda ievietošanas procesa izstrāde. Paralēli šīm darbībām tika veikts eksperiments, kura ietvaros divas atsevišķas ekspresijas plazmīdas tika secīgi transformētas S.cerevisiae rauga MMY28 celma šūnās un audzētas vidē bez histidīna, tādejādi pieļaujot tikai to šūnu augšanu, kuru ekspresētais receptors tiek aktivēts. Iegūtie rezultāti viesa cerības, jo šūnas, kas saturēja abas plazmīdas auga nedaudz straujāk, kā tās kas saturēja tikai vienu.
Sistēmas validācija
Tā kā aktivitātes “Eksperimentālā izstrāde” ietvaros iegūtie rezultāti norādīja, ka izstrādātā eksperimentālā sistēma varētu stādāt, tad šīs aktivitātes ietvaros tika veikti pirmie eksperimenti, kas apstiprinātu šo pieņēmumu. Šo eksperimentu ietvaros tika sagatavota plazmīda, kurai a-MSH sekvences vietā atradās randomizēts peptīdu kodējošā sekvence. Tālākajā gaitā iegūtā plazmīda līdz ar MC4R saturošo plazīdu tika tika secīgi transformētas S.cerevisiae rauga MMY28 celma šūnās, vairākas dienas audzētas vidē bez histidīna un izdalītas no rauga šūnām. Iegūtās plazmīdas, kā arī randomizētās izejas plazmīdas randomizētais rajons tika sekvencētas pielietojot IonTorrent PGM sekvencēšanas iekārtu un iegūtie rezultāti parādīja, ka randomizācijas nevis ataudzēšanas procesā ir notikusi selektīva a-MSH saturoši klonu atlase. Tādēļ turpmākajos projekta posmos “Eksperimentālās izstrādes” aktivitātes ietvaros tiks uzlabots randomizācijas process.
Informācija publicēta: 29.03.2018.
Projekta progress:
2018. gada 1. aprīlis – 2018. gada 30. jūnijs
Eksperimentālā izstrāde
Šajā projekta posmā aktivitātes ietvaros tika sagatavota ekspresijas plazmīda kurā starp sekretējamo peptīdu un sekrēcijas signālu ir ievietots savienotājpeptīds. Turpmākajos projekta posmos tiks veikti izmēģinājuma eksperimenti, lai novērtētu jaunizveidotās plazmīdas darbības efektivitāti. Paralēli šim darbam tika arī izstrādāta jauna mērķa rajona randomizācijas stratēģija, kuras rezultātā a-MSH sekvences vietā tiks ievietota randomizētu peptīdu kodējošā sekvence, kā arī tika uzsākti pirmie tās efektivitātes izvērtēšanas eksperimenti.
Sistēmas Validācija
Lai arī iepriekšējie sistēmas validācijas eksperimenti uzrādīja uz reandomizācijas procesa trūkumiem to rezultātā tika arī iegūti samērā plaši dati. Tādēļ šajā projekta posmā sistēmas validācijas aktivitātes ietvaros tika īstenota padziļināta to analīze un iegūtie rezultāti uzrādīja, ka datos, kas iegūti pēc audzēšanas, melanokortīnu receptoru farmakoforu saturošās sekvences bija sastopamas nedaudz biežāk kā datos, kas iegūti no randomizētās plazmīdas. Tādejādi norādot, ka arī pie šādas – suboptimālas randomizācijas sistēma darbojas un notiek funkcionālo klonu atlase.
Informācija publicēta 29.06.2018.
Projekta progress:
2018. gada 1. jūlijs – 2018. gada 30. septembris
Eksperimentālā izstrāde
Šajā projekta periodā tika veikti jaunās randomizācijas stratēģijas pārbaudes eksperimenti. To ietvaros izmantojot jaunizveidotu praimeru pāri tika veikta visas plazmīdas amplifikācija, kam sekoja ligēšana un transformācija. Tomēr gala rezultātā tika iegūts tikai neliels skaits plazmīdas pozitīvu koloniju. Lai arī šie rezultāti nebija daudzsološi pēc ataudzēšanas, tika veikta randomizētās plazmīdas nākamās paaudzes sekvencēšana, un iegūto datu analīze. Tās rezultātā tika noskaidrots, ka randomizācijas process pēc būtības bija veiksmīgs, jo iegūto ņolasījumu kopā nebija atrodami a-MSH kodējošas sekvences. Tādēļ, lai palielinātu plazmīdas pozitīvo koloniju skaitu tika veikta nākamā randomizācijas procesa uzlabošana, kas palielināja koloniju skaitu 10 reizes, tomēr arī šāds rezultāts nesasniedz nepieciešamo randomizācjias līmeni. Šī iemesla dēļ uzsākti nākamie uzlabošanas mēģinājumi, kuru rezultāts tiks noskaidrots nākamajā projekta posmā.
Sistēmas Validācija
Šajā projekta posmā aktivitātes ietvaros tika veikti sistēmas validācijas eksperimenti, izmantojot veiksmīgāko no Eksperimentālās izstrādes aktivitātē iegūtajām randomizētajām plazmīdām. To ietvaros rauga šūnas pēc secīgas transformācijas MC4R saturošo un randomizēto plazmīdu tika divas nedēļas audzēti bez histidīna vidē. Pēc eksperimenta noslēgšanās no kultūras tika izdalīta selektētā plazmīda un pašreiz notiek tās sekvencēšanas analīze.
Informācija publicēta 28.09.2018.
Projekta progress:
2018. gada 1. oktobris – 2018. gada 31. decembris
Eksperimentālā izstrāde
Šī projekta perioda sākuma posmā tika izstrādāts paņēmiens randomizētas plazmīdas iegūšanai, kas ietvēra DNS oligonukleotītu, kuru pirmie seši 5’ gala nukleotīdi bija aizstāti ar ribonukleotīdiem izmantošanu. Šo darbu ietvaros tika veikta visas plazmīdas amplifikācijas reakcija un iegūtais produkts tika apstrādāts ar RNāzi H, kas specifiski šķeļ tikai RNS/DNS hibrīdās dubultspirāles RNS pusi tādejādi radot 3’pārkari. Pēc šādi iegūtās plazmīdas ligēšanas tā tika transformēta E.coli šūnās un ataudzēta uz petri plates. Diemžēl, šādi iegūtās plazmīdas randomizācijas efektivitāte būtiski neatšķīrās no sākotnējo mēģinājumu efektivitātes. Veicot padziļinātu rezultātu analīzi tika secināts, ka ologonukleotīdu RNS daļa amplifikācijas temperatūras izmaiņu rezultātā ir pakļauta auto degradācijai, kas novērsa pārkaru veidošanos un samazināja ligēšanas efektivitāti. Tādēļ projekta perioda otrajā daļā tika izstrādāta alternatīva pārkaru veidošanas stratēģija, kas ietvēra viena randomizācijas oligonukleotīdu 5’ galiem tuva dezoksitimidīna aizvietošanu ar dezoksiuracilu un pēc amplifikāciajs apstrādi ar UNG.
Sistēmas Validācija
Šajā projekta posmā aktivitātes ietvaros tika veikta iepriekšējos posmos veikto sekvencēšans rezultātu analīze. Iegūtie rezultāti uzrādīja, ka pēc būtības selekcijas sistēma darbojas, jo pēc audzēšanas iegūtie sekvenču nolasījumi saturēja a-MSH kodējošo sekvenci, savukārt tie nebija atrodami randomizānijas plazmīdas nolasījumu klāstā.
Informācija publicēta 28.12.2018.
Projekta progress:
2019. gada 1. janvāris – 2019. gada 31. marts
Eksperimentālā izstrāde
Šajā projekta periodā tika īstenoti pirmie eksperimenti, kuru ietvaros tika izmantoti randomizācijas oligonukleotīdi ar 5’ galā iestrādātu dezoksiuracilu. Tomēr, visi veiktie amplifikācijas mēģinājumi bija nesekmīgi. Ņemot vērā, ka vairumā iepriekš veikto eksperimentu pašas plazmīdas amplifikācija nesagādāja grūtības, tika secināts, ka ieviesto nukleotīdu sekvences izmaiņu rezultātā iegādātajam randomizācijas praimerim ir ļoti spēcīga otrējā struktūra, kas nepieļauj tā piesaisti pie plazmīdas. Šo pieņēmumu apstiprināja arī veiktā in-silico struktūras simulācija. Tādēļ pielietojot tos pašus principus tika izstrādāts alternatīvs praimera variants, kura in-silico struktūras simulācija neuzrādīja spēcīgu otrējo struktūru veidošanos. Tālākie eksperimenti izmantojot šo praimeri tiks veikti nākamo projekta posmu ietvaros.
Sistēmas Validācija
Šajā projekta posmā aktivitātes ietvaros tika optimizēts sekvencēšanas bibliotēku sagatavošanas process. Šo darbu ietvaros tika uzlabota rauga plazmīdu izdalīšanas procedūra un optimizēti randomizētā rajona amplifikācijas apstākļi.
Informācija publicēta 29.03.2019.
Projekta progress:
2019. gada 1. aprīlis – 2019. gada 30. jūnijs
Eksperimentālā izstrāde
Šajā projekta periodā tika pabeigti iepriekš uzsāktie eksperimenti ar alternatīvajiem dezoksiuracilu saturošajiem praimeriem. Tomēr arī šajā gadījumā visi veiktie amplifikācijas mēģinājumi, diemžēl, bija nesekmīgi. Lai izskaidrotu iegūtos rezultātus, tika veikta zinātniskās literatūras analīze, kuras ietvaros tika salīdzinātas dažādu termostabilo polimerāžu īpašības. Šīs izpētes rezultātā tika secināt, ka iepriekš izmantotā enzīma aktivitāti negatīvi ietekmē ozligonukleotīdu sastāvā esošais dezoksiuracils, tādēļ visiem iepriekš izstrādātajiem praimeru pāriem tika atkārtoti veikti plazmīdas amplifikācijas eksperimenti, izmantojot īpaši piemeklētu – uridīna tolerantu polimerāzi. Šo darbību rezultāti apstiprināja izvirzītās hipotēzes pareizību un ar sākotnējā praimeru pāra palīdzību iegūtais produkts tika apstrādāts ar uracil-DNS glikozilāzi, lai uracila vietā radītu abāzisku pozīciju. Saskaņā literatūrā pieejamiem datiem, šāda pozīcija paaugstinātas temperatūras apstākļos ir pakļauta palielinātam spontānās šķelšanās riskam, kas radītu cirkularizāciju veicinošos “lipīgos” galus. Tomēr šādi radītās pazmīdas transformācija E.coli šūnās neuzrādīja vēlamo koloniju skaita palielināšanos, tādēļ tika secināts, ka spontānā šķelšanās nav pietiekami efektīva un ir nepieciešams to veicināt izmantojot enzimātiskos reakcijas katalizatorus. Tālākajā darba gaitā, lai sasniegtu izvirzīto rezultātu no kompānijas “NEB” tika iegādāts USER enzīmu maisījums, kura pielietošana būtiski palielināja transformācijas pozitīvo koloniju skaitu, tādejādi sekmīgi noslēdzot eksperimentālās izstrādes aktivitāti.
Sistēmas Validācija
Šajā projekta posmā, aktivitātes ietvaros tika būtiski uzlabots sekvencēšanas bibliotēku sagatavošanas process un izstrādāti praimeri, ar kuru palīdzību sekvencēšanu būs iespējams veikt uz BMC nesen iegādātās Illumina MiSeq sekvencēšanas iekārtas, kas sniedz ievērojami precīzākus datus par iepriekš izmantoto IonTorrent PGM iekārtu. Paralēli minētajam tika arī būtiski uzlabota arī plazmīdu izdalīšanas procedūra no rauga šūnām, kā rezultātā ievērojami paaugstināsies nākotnē iegūto rezultātu ticamība un uzsākti sistēmas validācijas eksperimenti izmantojot Eksperimentālās izstrādes aktivitātes ietvaros rādīto plazmīdu randomizācijas paņēmienu.
Informācija publicēta 28.06.2019.
Projekta progress:
2019. gada 1. jūlijs – 2019. gada 30. septembris
Sistēmas Validācija
Šajā projekta posmā, aktivitātes ietvaros tika veikti visas selekcijas sistēmas validācijas eksperimenti. To ietvaros humanizētā S.cerevisiae rauga celma MMY28 šūnās tika ietransformēta MC4R kodējošo sekvenci saturoša ekspresijas plazmīda un pēc transformācijas pozitīvo klonu atlases, tika veikti aktivācijas eksperimenti, lai identificētu trīs klonus ar visaugstāko aktivācijas efektivitāti. Pēc identifikācijas, šajos klonos tika ietransformēta randomu peptīdu kodējošā plazmīda un 12 dienas tika veikta selektīvā audzēšana un sākot ar 3 dienu tika ievākti plazmīdas izdalīšanai un randomā rajona sekvencēšanai paredzētie paraugi. Iegūtie rezultāti uzrādīja, ka farmakoforu saturošu peptīdu kodējošās plazmīdas īpatsvars būtiski pieauga no 0.007% eksperimenta 1. dienā līdz ~10 eksperimenta 5. dienā un saglabājās nemainīgs visu atlikušo eksperimenta laiku. Tādejādi šie rezultāti uzrāda, ka izstrādātā ligandu selekcijas sistēma ir funkcionāla un turpmākajos pētījuma posmos tiks veikta tās validācijas ar cilvēka MC3R un ascīdijas oreksīna receptoram līdzīgo receptoru.
Intelektuālā īpašuma tiesību identifikācija
Šīs projekta aktivitātes ietvaros tika uzsākta literatūras datu analīze ar mērķi apkopot visu pieejamo informāciju par ligandu selekcijas randomizācijas sistēmām.
Informācija publicēta 30.09.2019.
Projekta progress:
2019. gada 1. oktobris – 2019. gada 31. decembris
Sistēmas Validācija
Šajā projekta posmā, aktivitātes ietvaros tika turpināti visas selekcijas sistēmas validācijas eksperimenti. To ietvaros humanizētā S.cerevisiae rauga celmu MMY28 (Gas) un MMY14 (Gaq) šūnās tika ietransformēta MC3R kodējošo sekvenci saturoša ekspresijas plazmīda un pēc transformācijas pozitīvo koloniju atlases, piecām no katras transformācijas kolonijām tika veikti aktivācijas eksperimenti, lai identificētu kultūras ar visaugstāko aktivācijas efektivitāti, bet diemžēl nevienā no gadījumiem liganda atkarīga augšanas ātruma izmaiņa netika novērota. Visticamāk šī situācija ir skaidrojama ar faktu, ka receptora klātbūtne bija pietiekama, lai aktivizētu iekš šūnas signalizācijas kaskādes, jo kultūras blīvums pozitīvās kontroles bedrītēs bija identisks ar blīvumu pārējās bedrītēs. Šī iemesla dēļ darbi ar MC3R netika turpināti, bet tika uzsākti eksperimenti ar CIHCR. Līdzīgi kā iepriekš arī šajā gadījumā humanizētā S.cerevisiae rauga celmu MMY28 (Gas) un MMY14 (Gaq), kā arī MMY19 (Ga12), MMY20 (Ga13) and MMY20 (Ga14) šūnās tika ietransformēta CIHCRkodējošo sekvenci saturoša ekspresijas plazmīda un pēc transformācijas pozitīvo koloniju atlases, piecās plazmīdu saturošas kolonijās tika ietransformēta randomu peptīdu kodējošā plazmīda, kam sekoja 12 dienas ilga selektīvā audzēšana un sākot ar 3 dienu tika ievākti plazmīdas izdalīšanai un randomā rajona sekvencēšanai paredzētie paraugi. Iegūtie rezultāti, diemžēl bija negatīvi – netika atrasts neviens dažādos laika punktos diferenciāli pārstāvēts peptīds. Paralēļi minētajiem darbiem tika sagatavota un žurnālā “Nucleic acids research” iesniegta publikācija, ka aprakstīja projekta izstrādes gaitā izstrādāto randomizācijas paņēmienu.
Intelektuālā īpašuma tiesību identifikācija
Šīs projekta aktivitātes ietvaros tika paveikta visu projekta gaitā radīto intelektuālo īpašumu identifikācija, kā arī sagatavots ziņojums par to komercializācijas iespējām.
Informācija publicēta 30.12.2019.