Borrelia burgdorferi bakteriofāga strukturāli pētījumi
Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) darbības programmas “Izaugsme un nodarbinātība” 1.1.1. specifiskā atbalsta mērķa “Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā” 1.1.1.2. pasākuma “Pēcdoktorantūras pētniecības atbalsts” ietvaros.
Projekta nosaukums: Borrelia burgdorferi bakteriofāga strukturāli pētījumi
Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.2/VIAA/4/20/704
Projekta izpildes termiņš: 2021. gada 1. janvāris – 2023. gada 30. jūnijs
Projekta kopējais finansējums: 111 505.00 EUR
Projekta īstenotājs: Dr. biol. Jānis Rūmnieks
Borrelia burgdorferi bakteriofāgi (fāgi) ir nozīmīgs, bet mazizpētīts Laima slimības izraisītājbaktērijas bioloģijas aspekts. B. burgdorferi šūnās plaši izplatītā plazmīdu grupa cp32 patiesībā ir latenti neparasta bakteriofāga φBB1 genomi, kuri var tikt ierosināti veidot vīrusa daļiņas un lizēt to saimniekbaktērijas, taču gandrīz nekas nav zināms par tam pamatā esošajiem mehānismiem. φBB1 bakteriofāga strukturālie proteīni ir īpaši atšķirīgi un tiem ir ļoti maza vai nekāda sekvences līdzība ar citiem zināmiem vīrusiem.
Projekta mērķis ir veikt detalizētu φBB1 bakteriofāga struktūras izpēti, izmantojot krio-elektronmikroskopijas un rentgenstaru kristalogrāfijas metodes. Iegūtā augstas izšķirtspējas trīsdimensionālā struktūra ļaus definēt funkciju vairāk nekā desmit šobrīd neskaidras nozīmes fāga proteīniem un parādīs molekulāro uzbūvi evolucionāri atšķirīgai baktēriju vīrusu grupai. Projekta gaitā iegūtajiem rezultātiem būs ievērojama vērtība borēliju un bakteriofāgu fundamentālas izpētes jomā, kā arī tie radīs iespējas tālākiem pielietojamiem pētījumiem, lai attīstītu jauna veida pieejas un līdzekļus Laima slimības ārstēšanai.
Informācija publicēta 04.01.2021.
Projekta progress
2021. gada 1. janvāris – 2021. gada 31. marts
Lai atvieglotu φBB1 strukturālo proteīnu pētījumus, projektu uzsākot, vispirms tika veikta bakteriofāga visa morfoģenēzes gēnu moduļa PCR amplifikācija no Borrelia burgdorferi cp32-1 plazmīdas un tā klonēšana Escherichia coli plazmīdu vektorā. Izmantojot šo konstrukciju par pamatu, tika sākts darbs pie bakteriofāga kapsīdu (“galvu”) veidojošo proteīnu producēšanas ar mērķi iegūt šo fāga sastāvdaļu E. coli sistēmā. Šim nolūkam attiecīgo proteīnu kodējošās secības gan atsevišķi, gan pa vairākām kopā tika klonētas ekspresijas vektoros un pārbaudīta to ekspresija. Provizoriski rezultāti liecina, ka attiecīgie proteīni E. coli sistēmā var tikt producēti augstā līmenī un ir pazīmes, ka tās veido kapsīdām līdzīgas struktūras.
Paralēli rekombinantajai pieejai tika arī uzsākti mēģinājumi iegūt φBB1 bakteriofāga daļiņas no B. burgdorferi šūnām indukcijas rezultātā, pārbaudot dažādas indukcijas metodes un bakteriofāga koncentrēšanas paņēmienus.
Informācija publicēta 31.03.2021.
Projekta progress
2021. gada 1. aprīlis – 2021. gada 30. jūnijs
Escherichia coli sistēmā rekombinanti producētās φBB1 kapsīdas proteīnu veidotās struktūras tika analizētas elektronu mikroskopā ar negatīvās krāsošanas metodi, kur tika apstiprināts, ka tās veido homogēnas prokapsīdas. Tika izstrādāta attīrīšanas shēma, lai iegūtu šīs struktūras augstā tīrības pakāpē. Tika uzsāktas darbības rekombinanta φBB1 termināzes kompleksa iegūšanai, kas nepieciešams, lai mēģinātu prokapsīdas in vitro piepildīt ar DNS, tādējādi iegūstot pabeigtas kapsīdu struktūras.
Tika arī sākts eksperimentālais darbs φBB1 pamatplātnes iegūšanai Escherichia coli sistēmā rekombinantas ekspresijas ceļā. Šim nolūkam attiecīgo proteīnu kodējošās secības gan atsevišķi, gan pa vairākām kopā tika klonētas ekspresijas vektoros un pārbaudīta to ekspresija. Pamatplātnes proteīnu ekspresijas līmenis bija atšķirīgs un norisinājās darbs pie to ekspresijas līmeņa optimizācijas.
Informācija publicēta 30.06.2021.
Projekta progress
2021. gada 1. jūlijs – 2021. gada 30. septembris
Turpinājās darbs pie rekombinanta φBB1 termināzes kompleksa iegūšanas. Tika izmēģinātas dažādas ekspresijas metodes, afinitātes attīrīšanas iezīmes un attīrīšanas metodes un tika atrasti apstākļi, kādos termināzes kompleksu iespējams iegūt šķīstošā veidā. Tika veikta kompleksa attīrīšana analītiskos apjomos un veikti pirmie mēģinājumi in vitro iepakot DNS φBB1 prokapsīdās. Tika arī sākts eksperimentālais darbs dažādu plazmīdu konstrukciju izveidošanai φBB1 astes proteīnu rekombinantai ekspresēšanai Escherichia coli sistēmā un to ekspresijas līmeņa pārbaudei, kā arī turpinājās darbs pie dažādu plazmīdu konstrukciju izveides un ekspresijas apstākļu piemeklēšanas φBB1 pamatplātnes kompleksa iegūšanai Escherichia coli sistēmā.
Informācija publicēta 30.09.2021.
Projekta progress
2021. gada 1. oktobris – 2021. gada 31. decembris
Turpinājās darbs pie φBB1 astes proteīnu rekombinantas ekspresijas eksperimentiem Escherichia coli sistēmā. Tika arī izveidotas divu plazmīdu sistēmas abu termināzes subvienību, kā arī dažādai pamatplātnes proteīnu koekspresijai, lai censtos uzlabot to ekspresijas līmeni. Papildus tam norisinājās mēģinājumi atrast piemērotus eksperimentālos apstākļus φBB1 prokapsīdu in vitro pakošanai ar DNS.
Tika arī uzsākts darbs pie φBB1 bakteriofāga strukturālās analīzes. φBB1 prokapsīdu struktūras tika attīrītas un aizsūtītas apskatei krio-elektronu mikroskopā CEITEC institūtā Čehijā. Pirmie rezultāti liecina, ka paraugs ir homogēns un piemērots tālākai augstas izšķirtspējas datu iegūšanai.
Informācija publicēta 30.12.2021.
Projekta progress
2022. gada 1. janvāris – 2022. gada 31. marts
Norisinājās darbs pie φBB1 astes un pamatplātnes proteīnu koekspresijas sistēmas izveides Escherichia coli. Tika arī izveidotas plazmīdu konstrukcijas φBB1 pamatplātnes centrālā mezgla proteīna, astes smailes proteīna un astes šķiedras proteīna ekspresijai. Tika veikti to ekspresijas eksperimenti un noskaidroti apstākļi, kādos šos proteīnus var iegūt šķīstošā veidā, vai arī nepieciešamības gadījumā tika veikta papildus plazmīdu konstrukciju izveide ar šķīdību uzlabojoša domēna pievienošanu mērķa proteīniem. Pamatplātnes centrālā mezgla proteīnam un astes smailes proteīnam tika izstrādāti attīrīšanas protokoli. Proteīni tika attīrīti līdz homogenitātei preparatīvā daudzumā un tika uzsākti to kristalizēšanas mēģinājumi.
Informācija publicēta 31.03.2022.
Projekta progress:
- gada 1. aprīlis – 2022. gada 30. jūnijs
Tika izstrādāta φBB1 astes šķiedras proteīna attīrīšanas shēma un proteīns attīrīts preparatīvā daudzumā. Tika veikti astes smailes proteīna un astes šķiedras proteīna kristalizēšanas apstākļu noskaidrošanas un optimizēšanas eksperimenti un iegūti kristāli turpmākai pārbaudei sinhrotronā. Norisinājās arī darbs pie astes smailes un astes šķiedras proteīnu iegūšanas ar selenometionīna iezīmi un to attīrīšanas un kristalizēšanas.
Tika iegūta augstas izšķirtspējas φBB1 prokapsīdu krio-elektronu mikroskopijas attēlu datu kopa un sākta tās apstrāde. Tika veikta filmu kustības korekcija, iegūto mikrogrāfiju kontrasta pārneses funkciju novērtēšana, daļiņu atlase un sākotnējā prokapsīdu 3D rekonstrukcija.
Informācija publicēta 30.06.2022.
Projekta progress:
- gada 1. jūlijs – 2022. gada 30. septembris
Escherichia coli ekspresijas sistēmā tika producēti φBB1 galvas aizbāžņa un galvas-astes savienotājproteīni un tie tika attīrīti līdz homogenitātei. Norisinājās darbs pie bakteriofāga termināzes enzīma iegūšanas ar augstāku šķīdību.
Tika savākti rentgenstaru difrakcijas dati no φBB1 astes šķiedras un astes smailes proteīna kristāliem līdz attiecīgi 2.8 un 2.4 Å izšķirtspējai. Turpinājās darbs pie attiecīgo ar selenometionīnu iezīmētu proteīnu kristalizācijas, lai varētu noteikt to struktūru. Turpinājās φBB1 prokapsīdu krio-EM datu apstrāde, kā rezultātā tika rekonstruēta simetrizēta prokapsīdu elektronu blīvuma karte 3.4 Å izšķirtspējā.
Informācija publicēta 30.09.2022.
Projekta progress
- gada 1. oktobris – 2022. gada 31. decembris
Notika mēģinājumi in vitro iepakot φBB1 prokapsīdās DNS, tomēr netika iegūti pārliecinoši pierādījumi par to, ka iepakošanas sistēma darbojas kā iecerēts. Tika izveidotas plazmīdu konstrukcijas φBB1 prokapsīdu ekspresijai ar inaktivētiem dažādiem tās veidojošajiem strukturālajiem proteīniem. To ekspresijas rezultātā iegūto daļiņu esamība un to morfoloģija tika analizēta elektronu mikroskopā. Prokapsīdu veidojošie proteīni arī tika producēti un attīrīti atsevišķi ar mērķi izveidot in vitro sistēmu prokapsīdas veidošanās mehānisma izpētei. Tika izstrādātas attīrīšanas shēmas pieciem no sešiem strukturālajiem proteīniem. Tika arī veikti eksperimenti, inkubējot φBB1 prokapsīdas pie dažādiem pH un analizējot to morfoloģijas izmaiņas elektronu mikroskopā.
Informācija publicēta 30.12.2022.
Projekta progress
- gada 1. janvāris – 2023. gada 31. marts
Tika attīrīti jauni φBB1 prokapsīdu paraugi analīzei krio-elektronu mikroskopijā. CEITEC institūtā Brno, Čehijā tika sagatavoti φBB1 prokapsīdu paraugi pie pazemināta pH un no šiem paraugiem ievākta augstas izšķirtspējas krio-EM datu kopa. Turpmākajā darba gaitā no šiem datiem tika aprēķināta šīs prokapsīdu formas trīsdimensionālā struktūra. Norisinājās arī darbs pie iepriekš iegūtās pie neitrāla pH savākto dabiskās formas prokapsīdu datu apstrādes, izdalot un aprēķinot dažādu prokapsīdu subkomponentu struktūras. Šādā veidā tika iegūtas φBB1 portāla, prokapsīdas gala un vidusdaļas kā arī prokapsīdas iekšējo sastatņu struktūras ievērojami augstākā izšķirtspējā nekā sākotnējā visas daļiņas kopējā struktūrā.
Informācija publicēta 31.03.2023.
Projekta progress:
- gada 1. aprīlis – 2023. gada 30. jūnijs
Tika pabeigts darbs pie φBB1 prokapsīdu trīsdimensionālās struktūras noskaidrošanas. Tika rekonstruētas portālu saturošā prokapsīdas gala un visas daļiņas asimetriskas struktūras un uzbūvēti atbilstoši modeļi. Iegūtās trīsdimensionālās struktūras tika sagatavotas ievietošanai Proteīnu datu bankā (PDB) un Elektronu mikroskopijas datu bankā (EMDB). Norisinājās darbs pie iegūto rezultātu apkopošanas un zinātniska raksta manuskripta sagatavošanas. Rezultāti arī tika sagatavoti prezentēšanai konferencē Viruses of Microbes 2023 stenda referāta formā.
Informācija publicēta 30.06.2023.