Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) darbības programmas “Izaugsme un nodarbinātība” 1.1.1. specifiskā atbalsta mērķa “Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā” 1.1.1.2. pasākums “Pēcdoktorantūras pētniecības atbalsts” ietvaros.
Projekta nosaukums: Daudzziedu airenes raibuma vīrusa kodēto proteīnu struktūru un funkcionālā izpēte
Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.2/VIAA/3/19/462
Projekta izpildes termiņš: 36 mēneši (2020. gada 1. marts – 2023. gada 28. februāris)
Projekta kopējais finansējums: 133 304,57 EUR
Projekta īstenotājs: Dr. biol. Ina Baļķe
Pētījuma zinātniskais mērķis ir, izmantojot Daudzziedu airenes raibuma vīrusu kā pētījuma modeli, lai noteiktu vīrusa kodēto proteīnu strukturālās un funkcionālās īpašības, kas ļaus labāk izprast vīrusu proteīnu lomu tā dzīves ciklā.
Sobemovīrusi ir ss(+)RNS vīrusi, kas inficē gan viendīgļlapjus, gan divdīgļlapjus. Tā kā to genomi ir nelieli (4-4.5 bp) un vienkāršas uzbūves (kodē 5 ORF, nav fragmentēti), tos var izmantot kā modeļobjektus vīrusu izpētē. To genomi ir salīdzinoši labi raksturoti, taču to proteīnu struktūras un jo īpaši to loma un mijiedarbība infekcijas laikā vēl jānoskaidro. Globalizācija, apmaiņa ar inficētu augu materiālu un jaunu kultūraugu šķirņu ieviešana, ir veicinājis vīrusu izplatību. Vairāki šīs ģints pārstāvji ir ekonomiski nozīmīgi patogēni. Projekta ietvaros tiks veikta vīrusa kodēto proteīnu struktūru noteikšana ar X-ray difrakcijas metodi, ja nepieciešams tiks izmantota arī Crio-EM, KMR, lai to īstenotu, ir nepieciešams augstas tīrības un koncentrācijas paraugs. Tāpēc tie tiks ekspresēti baktēriju ekspresijas sistēmā un attīrīti. Funkcionalitātes pētījumos tiks izmantoti protoplasti, kuros ar fluorescējošu proteīnu vai ar tā daļu sajūgtajiem vīrusa proteīniem, tiks pētīta to lokalizācija šūnā, kā arī to savstarpējā mijiedarbība, kā vizualizācijas metodi izmantojot fluoriscento un konfokālo mikroskopus. Iegūtās zināšanas ļaus izprast infekcijas norisē un atslēgas posmos iesaistītos proteīnus un to funkcijas. Savukārt noskaidrojot proteīnu 3D struktūru ir iespējams pēc datu bāzēs esošajiem struktūru analogiem noskaidrot nezināma proteīna funkciju. Šo informāciju var izmantot vīrusu rezistentu augu šķirņu izveidei un citu vīrusu (zīdītāju) pētījumos. Tiks iegūta arī svarīga informācija par vīrusa vektora iespējamo izmantošanu rekombinantu proteīnu ekspresijai augos. Projekts savā ziņā ir unikāls ar to, ka tiks veikti proteīnu-proteīnu mijiedarbību pētījumi protoplastos, kā arī iegūtas 3D struktūra/as mazpētītiem vīrusa proteīniem, sniedzot augstvērtīgu informāciju virusoloģijas nozarei kopumā.
Informācija publicēta 02.03.2020.
Projekta progress
2020 gada 1. marts – 2020. gada 31. maijs
Darbības Nr.1 ietvaros ir veikta, iepriekš izveidoto RGMoV 3C serīna proteāzes katalītiskā centra mutanta (Procm) ar un bez transmembranālā domēna (TMD), plazmīdu ekspresijas pārbaude E.coli ekspresijas celmā C2566. SDS-PAA gelā tika analizēts šūnu kopējais lizāts, kā arī pēc šūnu dezintegrācijas nogulsnes un supernatants, lai pārliecinātos par ekspresijas līmeni un proteīnu šķīdību. Tā kā abi Procm varianti ir šķīstošajā frakcijā, tad tika veikta abu proteīnu preperatīva attīrīšana uz Ni2+ afīnās hromatogrāfijas kolonnas, kā arī testēta to papildus attīrīšana uz gelfiltrācijas kolonnas, tīrāka materiāla iegūšanai 3D struktūras noteikšanai. Procm ar TMD tika veikta attīrīšanas apstākļu optimizācija. Ekspresēta katalītiski aktīvā Pro un attīrīta, lai veiktu funkcionalitātes pētījumus. Uzsākts darbs pie P1 proteīna ekspresijas un attīrīšanas no ieslēgumķermeņiem (IB).
Darbības Nr.3 veikta papildus literatūras analīze, lai izveidotu konstrukcijas ar sašķeltajiem fluoriscentajiem proteīniem (sFP) proteīnu mijiedarbības pētījumiem. Uzsākts darbs pie izveidojamo konstrukciju dizaina.
Informācija publicēta 31.05.2020.
Projekta īstenošanas progress
2020. gada 1. jūnijs – 2020. gada 31. augusts
Darbības Nr.1 ietvaros ir izveidota Procm bez TMD attīrīšanas shēma. Procm bez TMD attīrīta preparatīvā daudzumā kristalizācijas eksperimentiem. Turpinās darbi gan pie Procm ar TMD attīrīšanas apstākļu optimizācijas, gan P1 proteīna optimālākās attīrīšanas metodes no IB izstrādes, kā arī pie katalītiski aktīvās Pro funkcionalitātes pētījumiem.
Darbības Nr.2 ietvaros uzsākts darbs pie Procm bez TMD kristalizācijas un ko-kristalizācijas ar peptīdu apstākļu testēšanas.
Darbības Nr.3 ietvaros uzsākts darbs pie sFP proteīnu mijiedarbības pētījumiem paredzēto plazmīdu izveides.
Informācija publicēta 31.08.2020.
Projekta īstenošanas progress
2020. gada 1. septembris – 2020. gada 30. novembris
Darbības Nr.1 ietvaros turpinās darbi gan pie Procm ar TMD attīrīšanas apstākļu optimizācijas, gan P1 proteīna optimālākās attīrīšanas metodes no IB izstrādes. Veikta P16 N-terminālā domēna P10 ekspresija E.coli ekspresijas celmā C2566. Veikta ekspresijas, proteīna šķīdības analīze SDS-PAA gelā. Veikta P10 attīrīšana uz Ni2+ afīnās hromatogrāfijas kolonnas. Veikta P16 ekspresija E.coli ekspresijas celmā C2566. Veikta P16 ekspresijas klonu analīze SDS-PAA gelā. Turpinās darbs pie katalītiski aktīvās Pro funkcionalitātes pētījumiem.
Darbības Nr.2 ietvaros noteikta 3D struktūra Procm bez TMD un bez peptīda. Uzsākts parbs pie P16 N-terminālā domēna P10 kristalizācijas apstākļu testēšanas. Uzsākts parbs pie publikācijas sagatavošanas par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo Pro ar un bez kofaktora.
Darbības Nr.3 ietvaros izveidotas konstrukcijas sFP eksperimentiem. Uzsākts darbs pie sFP konstrukciju ekspresijas pārbaudes E.coli sitēmā.
Informācija publicēta 30.11.2020.
Projekta īstenošanas progress
2020. gada 1. decembris – 2021. gada 28. februāris
Darbības Nr.1 ietvaros darbs tiek turpināts pie P1 refoldinga buferu optimizācijas, kā arī pie Procm ar TMD attīrīšanas apstākļu optimizācijas. Veikta P16 N-terminālā domēna P10 preperatīva ekspresija E.coli un attīrīšana kristalizācijas eksperimentiem. Izveidots jauns ekspresijas vektors katalītiski aktīvajai ∆117Pro ar N-gala 6 histidīnu tagu, ātrākai Pro attīrīšanai. Veikta ∆117Pro ekspresija E.coli ekspresijas celmā C2566, ekspresijas, proteīna šķīdības analīze SDS-PAA gelā, kā arī ∆117Pro attīrīta uz Ni2+ afīnās hromatogrāfijas kolonnas. Uzsākts darbs pie ORFx kodētā proteīna Px ekspresijas konstrukcijas izveides.
Darbības Nr.2 ietvaros uzsakti P10 kristalizācijas apstākļu optimizācijas eksperimenti. Turpinās parbs pie publikācijas manuskripta gatavošanas par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo Pro ar un bez kofaktora.
Darbības Nr.3 turpinās darbs pie sFP konstrukciju ekspresijas pārbaudes E.coli sitēmā. Veikta literatūras analīze par pieejamajām protoplastu izolēšanas un transfekcijas metodēm.
Informācija publicēta 26.02.2021.
Projekta īstenošanas progress
2021. gada 1. marts – 2021. gada 31. maijs
Darbības Nr.1 ietvaros pārbaudīta P1 mijiedarbība ar RGMoV CP mRNS pēc refoldinga ar un bez Zn2+, izmantojot gel-shift metodi. Izveidota P1 refoldinga metode. Izmantojot šo metodi, P1 attīrīts preparatīvā daudzumā kristalizācijas optimizācijas eksperimentiem. Veikta ORFx kodētā proteīna Px ekspresija E.coli ekspresijas celmā C2566. Pārbaudīta tā ekspresija, šķīdība SDS-PAA gelā, kā arī Px attīrīšana uz Ni2+ afīnās hromatogrāfijas kolonnas. Veikti ∆117Pro ar N-gala 6 histidīnu tagu papildus attīrīšanas eksperimenti, izmantojot gelfiltrāciju.
Darbības Nr.2 ietvaros uzsakti P1 kristalizācijas apstākļu optimizācijas eksperimenti. Turpinās P10 kristalizācijas apstākļu optimizācijas eksperiments. Darbs turpinās pie publikācijas manuskripta gatavošanas par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo Pro ar un bez kofaktora.
Darbības Nr.3 uzsākts darbs pie literatūrā aprakstīto protoplastu izolēšanas un transfekcijas metožu apkopošanas.
Aktivitātē Nr. 5 tika izveidots virtuālais posteris “Fluoriscento proteīnu pielietojums augu vīrusu izpētē” “Eiropas Zinātnieku natkts” (30.04.2021.) ietvaros.
Informācija publicēta 31.05.2021.
Projekta īstenošanas progress
2021. gada 1. jūnijs – 2021. gada 31. augusts
Darbības Nr.1 ietvaros uzsākts darbs pie ORFx kodētā proteīna Px attīrīšanas optimizācijas. Uzsāts darbs pie VPg-RdRp sajūgtā proteīna ekspresijas E.coli ekspresijas celmā C2566 un attīrīšanas uz Ni2+ afīnās hromatogrāfijas kolonnas.
Darbības Nr.2 ietvaros tika trupināti uzsaktie P1 un P10 kristalizācijas apstākļu optimizācijas eksperimenti. Darbs turpinās pie publikācijas manuskripta uzlabošanas par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo Pro ar un bez kofaktora.
Darbības Nr.3 turpināts darbs pie literatūrā aprakstīto protoplastu izolēšanas un transfekcijas metožu apkopošanas.
Informācija publicēta 31.08.2021.
Projekta īstenošanas progress
2021. gada 1. septembris – 2021. gada 30. novembris
Darbības Nr.1 turpinās darbs pie ORFx kodētā proteīna Px attīrīšanas optimizācijas, kā arī VPg-RdRp sajūgtā proteīna attīrīšanas. Attīrīti P1 un P10 preparatīvā daudzumā kokristalizācijas eksperimentiem. Veikta ∆117Pro-N6H, Pro un VPg ekspresija un attīrīšana preparatīvos daudzumos FRET eksperimenta veikšanai.
Darbības Nr.2 ietvaros tika trupināti eksperimenti ar P1 un P10 kristalizāciju. Uzsākti kokristalizācijas eksperimenti ar P1 un P10. Darbs turpinās pie publikācijas manuskripta rediģēšanas par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo Pro ar un bez kofaktora.
Darbības Nr.3 veikta protoplastu izolēšana un transfekcijas pārbaude ar kontrolplazmīdu. Veikta transficēto protoplastu vizuāla apskate ar konfokālo mikroskopu.
Informācija publicēta 30.11.2021.
Projekta īstenošanas progress
2021. gada 1. decembris – 2022. gada 28. februāris
Darbības Nr.1 veikti ∆117Pro-N6H, ∆117Pro un VPg FRET eksperimenti pie dažādām temperatūrām un dažādos buferos, taču netika novērota fluoriscencs līmeņa izmaiņas, kas liecinātu par peptīda šķelšanu. Jāveic apstākļu otimizācija vai jāsamazina peptīda garums. Veikta preperatīva ∆50Procm ekspresija un attīrīšana preperatīvos daudzumos, kas tiks izmantots kā substrāts ∆117Pro in cis šķelšanas dinamikas analīzei ar un bez kofaktota – VPg.
Darbības Nr.2 ietvaros tika trupināts darbs pie kokristalizācijas eksperimentiem ar P1 un P10. Veikti manuskripta par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo ∆117Pro ar un bez kofaktora papildiāšana ar datiem par ∆117Procm kristālsturktūru, veikti manuskripta rediģēšanas darbi.
Darbības Nr.3 uzsākti darbi pie auzu protoplastu izolēšana un transfekcijas ar izveidotajiem plazmīdu konstruktiem, proteīnu mijiedarbību pētījumiem.
Informācija publicēta 28.02.2022.
Projekta īstenošanas progress
2022. gada 1. marts – 2022. gada 31. maijs
Darbības Nr.1 veikti ∆117Pro in cis šķelšanas dinamikas analīze ar un bez kofaktora – VPg, par substrātu izmantojot ∆50Procm. ∆117Pro in cis šķelšanas dinamika tika pārbaudīta pie trīs temperatūrām – +4°C, +23°C, +37°C, kā arī bez un ar 2 mM, 5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 un 2mM ZnCl2.
Darbības Nr.2 ietvaros tika trupināts darbs pie kokristalizācijas eksperimentiem ar P1 un P10. Veikti manuskripta par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo ∆117Pro ar un bez kofaktora papildiāšana ∆117Pro in cis šķelšanas dinamikas datiem.
Darbības Nr.3 turpinās darbi pie auzu protoplastu izolēšanas un transfekcijas ar izveidotajiem plazmīdu konstruktiem, proteīnu mijiedarbību pētījumiem.
Informācija publicēta 31.05.2022.
Projekta īstenošanas progress
2022. gada 1. jūnijs – 2022. gada 31. augusts
Darbības Nr.1 veikti ∆50Pro-C6H ekspresija un attīrīšana preperatīvos daudzumos, kas tiks izmantota in trans šķelšanas analīzei ar un bez kofaktora – VPg. Papildus tika veikta P1 optimizācijas eksperimenti šķīdības uzlabošanai, ekspresējot P1 BL21(DE3) E. coli ekspresijas celmā pēc Gillet et al., 2013 publicētajiem apstākļiem un P1 attīrīšanas apstākļiem.
Darbības Nr.2 ietvaros tika trupināts darbs pie kokristalizācijas un kristalizācijas eksperimentiem ar P1 un P10. Veikti manuskripta par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo ∆117Pro ar un bez kofaktora papildiāšana ar ∆50Pro-C6H in trans šķelšanas dinamikas datiem.
Darbības Nr.3 turpinās darbi pie auzu protoplastu transfekcijas ar izveidotajiem plazmīdu konstruktiem, proteīnu mijiedarbību pētījumiem. Veikti ∆117Pro in cis šķelšanas dinamikas analīze ar un bez kofaktora – VPg, par substrātu izmantojot ∆50Procm bez un ar 100 mM NaCl. Veikti ∆50Pro-C6H in trans šķelšanas analīzei ar un bez kofaktora – VPg, kā arī bez un ar 2 mM, CaCl2, 2 mM MgCl2, 2mM ZnCl2 un 100 mM NaCl.
Informācija publicēta 31.08.2022.
Projekta īstenošanas progress
- gada 1. septembris – 2022 gada 30. novembris
Darbības Nr.1 veikta VPg-RdRp un P16 ekspresija C2566 E. coli ekspresijas celmā un attīrīšana kristalizācijas un kokristalizācijas eksperimentiem. Uzsākta koekspresija RGMoV kodētajiem proteīnime E. coli ekspresijas sistēmā, potenciālo mijiedarbību identifikācijai.
Darbības Nr.2 ietvaros tika iesniegts publikācijas manuskripts par kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo ∆117Pro, ar un bez kofaktora un katalītīski neaktīvo ∆117Pro publicēšanai PNAS. Veikta in silico 3D struktūru modelēšana P16, Px un RdRp, izmantojot AlphaFold, kā arī strukturālo elementu noteikšana ar PsiPred.
Darbības Nr.3 turpinās darbi pie auzu protoplastu transfekcijas ar izveidotajiem plazmīdu konstruktiem proteīnu mijiedarbību un lokalizācijas pētījumiem.
Mobilitāte: Pabeigta 3 mēnešu mobilitāte (01.07.2022. – 30.09.2022.) Tallinas Tehniskajā Universitātē.
Informācija publicēta 30.11.2022.
Projekta progress
- gada 1. decembris – 2023. gada 28. februāris
Darbības Nr.1 uzsākta VPg-RdRp un P16 ekspresija un attīrīšana optimizācija kristalizācijas un kokristalizācijas eksperimentiem. Turpināta koekspresija RGMoV kodētajiem proteīniem E. coli ekspresijas sistēmā, potenciālo mijiedarbību identifikācijai.
Darbības Nr.2 ietvaros tika pārstrādāts un iesniegts publikācijas manuskripts par kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo ∆117Pro, ar un bez kofaktora un katalītīski neaktīvo ∆117Pro publicēšanai žurnālā IJMS.
Darbības Nr.3 turpinās darbi pie auzu protoplastu transfekcijas ar izveidotajiem plazmīdu konstruktiem proteīnu mijiedarbību un lokalizācijas pētījumiem. Apkopoti rezultāti no bakterilās divhibrīdu sistēmas par RGMoV proteīnu-proteīnu un poteinciālajām proteīnu-nukleīnskābes mijiedarbībām.
Informācija publicēta 28.02.2023.