Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) darbības programmas “Izaugsme un nodarbinātība” 1.1.1. specifiskā atbalsta mērķa “Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā” 1.1.1.2. pasākums “Pēcdoktorantūras pētniecības atbalsts” ietvaros.
Projekta nosaukums: “Jaunu augu izcelsmes enzīmu ekspresijas mikroorganismos optimizēšana to biotehnoloģiskiem pielietojumiem”
Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.2/VIAA/2/18/286
Projekta izpildes termiņš: 2019. gada 1. janvāris – 2022. gada 31. decembris
Projekta kopējais finansējums: 133 806,00 EUR
Projekta īstenotājs: PhD. Kaia Kukk
Pamatojoties uz pašreizējām ģenētiskajām, fitoķīmiskajām un pārtikas pārstrādes zināšanām par antociānu, projekts pārbaudīs dabisko krāsvielu ražošanas stratēģijas. Tai skaitā tiks pētīti gēni, kas kodē olbaltumvielas no antocianīna sintēzes, kas iegūti no sugas Lupinus angustifolius (šaurspalvu zilā lupīna) ar zilo antociānu spektru.
Dažas no galvenajām problēmām, kas saistītas ar antociānu kā dabisko krāsvielu plašu pielietojumu, ir to nestabilitāte šķīdumā, it īpaši neitrālā pH un, paaugstinātas temperatūras apstākļos, kad ir nosliece uz oksidēšanās procesu, reproducējot zilās krāsas. Tā kā lielākā daļa antocianīnu nav komerciāli pieejami, to funkcionālo īpašību pētīšana ir atkarīga no to produkcijas iegūšanas heterologās ekspresijas sistēmas vai izolācijas no kompleksiem augu ekstraktiem. Lai gan tika identificēti simtiem dažādu antociānu, tikai daži no tiem ir komerciāli pieejami, un tie ir ļoti dārgi (Zha,, J. & Koffas, M. A. G. (2017)). Projekta mērķis ir attīstīt jaunu augu enzīmu rekombinanto ekspresiju mikroorganismos (Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis papildus Saccharomyces cerevisiae), kas atbild par antociānu sintēzi augos. Potenciālie enzīmi ir: anthocyanin 5-O-glucosyl transferase, anthocyanin 3-O-glucoside coumaroyltransferase, anthocyanin 3-O-rutinoside coumaroyltransferase, anthocyanin 3-O-glucoside malonyltransferase. Projekts balstīts uz rauga ekspresijas sistēmu, lai spētu ražot fermentu, kas pielietojams pārtikas un kosmētikas rūpniecībā. Izstrādātie ražošanas protokoli izvēlētajiem fermentiem tiks izveidoti, lai nodrošinātu TRL 4 (tehnoloģija, kas ir apstiprināta laboratorijā) un ļautu virzīties uz nākamo līmeni.
Attīstot augu enzīmu rekombinanto ekspresiju mikroorganismos, būs iespējams izstrādāt jaunus fermentus, kas būs droši pielietojami pārtikas un kosmētikas krāsvielu ražošanā.
Informācija publicēta 02.01.2019.
Projekta progress:
2019. gada 1. janvāris – 2019. gada 31. marts
Pirmajos projekta mēnešos tika veikts plašs literatūras apskats un sakārtota jaunā darba vide. No Arabidopsis thaliana un Nicotiana tabacum lapām tika izdalīta RNS un sintezēta komplementārā DNS (cDNS). Tālāk, tika dizainēti specifiskie praimeri un veiksmīgi izmantoti 4-kumarāta-CoA ligāzes (viens no antocianīna sintēzes ceļa agrīnajiem posmiem) fermenta amplifikācijai no A. thaliana un N. tabacum cDNS. Tika veikti arī vairāki mēģinājumi izdalīt RNS no Vaccinium myrtillus un Vaccinium vitis-idaea liofilizētajām ogām. Notika arī semināri ar potenciālajiem nākotnes sadarbības partneriem Latvijas Universitātē un BIOR.
Informācija publicēta 29.03.2019.
Projekta progress:
2019. gada 1. aprīlis – 2019. gada 30. jūnijs
Laboratorijas apstākļos tika audzētas gan saulespuķes (Helianthus annuus), gan kliņģerītes (Calendula officinalis) augi. No jaunu augu lapām tika izdalīta RNS un sintezēta cDNS. Tālāk, tika dizainēti deģenerēti praimeri un veiksmīgi izmantoti 4-kumarāta-CoA ligāzes, halkona sintāzes un flavanona 3-hidroksilāzes fragmentu amplifikācijai no abiem augiem. Tika dizainēti specifiskie praimeri un veiksmīgi izmantoti halkona izomerāzes amplifikācijai no Arabidopsis thaliana un Nicotiana tabacum lapām.
Informācija ievietota 28.06.2019.
Projekta progress:
2019. gada 1. jūlijs – 2019. gada 30. septembris
Augu paraugi tika savākti no jūlija līdz septembrim un atbilstoši uzglabāti turpmākajiem eksperimentiem. RNS tika ekstrahēta no trīs Vaccinium sugu ogām (V. uliginosum, V. myrtillus un V. vitis-idaea) un četru ziedu ziedlapiņām no Asteraceae dzimtas (Centaurea cyanus, Cichorium intybus, Calendula officinalis un Helianthus annuus) augiem. Iegūtās RNS tika izmantotas cDNS sintēzei. Tika iegūti trīs līdz sešu olbaltumvielu secības fragmenti no pieciem augiem (4-kumarāta-CoA ligāzes, halkona sintāzes, flavanona 3-hidroksilāzes, dihidroflavonola 4-reduktāzes, antocianidīna sintāzes un flavanoid 3 ‘, 5’-hidroksilāzes) fragmenti.
Informācija ievietota 30.09.2019.
Projekta progress:
2019. gada 1. oktobris – 2019. gada 31. decembris
Darbs turpinājās ar antocianīnu sintēzes ceļa olbaltumvielu kodēto fragmentu sekvenēšanu. Tālāk, tika dizainēti specifiskie praimeri un izmantoti, lai iegūtu četru augu ar ziliem ziediem vai ogām (Centaurea cyanus, Cichorium intybus, Vaccinium uliginosum un Vaccinium myrtillus), sešu olbaltumvielu 3 ’sekvences. Tika veikti sākotnējie eksperimenti 5 ‘ sekvenču iegūšanai. Tika dizainēti specifiskie praimeri un veiksmīgi izmantoti halkona izomerāzes amplifikācijai no zemenēm (Fragaria ananassa). Ar plašāku auditoriju paveiktais darbs tika iepazīstināts televīzijas šovā “Izziņas impulss” LTV1 kanālā (05.12.2019).
Informācija publicēta 30.12.2019.
Projekta progress:
2020. gada 1. janvāris – 2020. gada 29. februāris
Darbs bija vērsts uz antocianīnu sintēzes ceļa olbaltumvielu 5 ’secību apstiprināšanu. Apvienojot 5 ‘ fragmentus ar iepriekš noteiktajiem 3’ fragmentiem (galvenokārt dihidroflavonola 4-reduktāzes un antocianidīna sintāzes secībām) tika iegūtas vairākas potenciālās pilna garuma sekvences. Pilna garuma sekvences, kas kodē halkonu sintāzi, iegūšanai tika izmantoti specifiski praimeri un RNS, kas ekstrahēta no rudzupuķu (Centaurea cyanus) lapām. Tika izveidots detalizēts protokols “Kā iegūt sekvences, kas kodē augu olbaltumvielas, par kurām nav pieejami genoma dati”.
Informācija publicēta 28.02.2020.
Projekta progress:
2021. gada 1. marts – 2021. gada 31. maijs
Paredzētās antocianīna 3-O-glikozīda 5-O-glikoziltransferāzes, antocianīna 3-O-glikozīda-6 ” – O-kumaroiltransferāzes un antocianīna 3-O-glikozīda-6 ‘- O-maloniltransferāzes sintētiskās sekvences no Lupinus un Vaccinium sugām tika pasūtītas un izmantotas transformēšanai Saccharomyces cerevisiae šūnās. Projekta sekvenēšanas datu pirmā daļa tika publicēta dokumentā ar identifikācijas numuru DOI 10.15156 / BIO / 807453. Tika uzlabots protokols, kurā aprakstītas to augu olbaltumvielu kodēšanas sekvences, par kurām nav pieejami genoma dati, un publicēts vietnē protocols.io (dx.doi.org/10.17504/protocols.io.btxwnppe).
Informācija publicēta 31.05.2021.
Projekta progress:
2021. gada 1. jūnijs – 2021. gada 31. augusts
Paredzētās antocianīna 3-O-glikozīda 5-O-glikoziltransferāzes, antocianīna 3-O-glikozīda-6 ” – O-kumaroiltransferāzes un antocianīna 3-O-glikozīda-6 ‘- O-maloniltransferāzes sintētiskās sekvences no Lupinus un Vaccinium sugām tika izmantotas transformēšanai Pichia pastoris šūnās. Olbaltumvielas tika ekspresētas S. cerevisiae un P. pastoris. Tika iegūtas vairākas pilna garuma sekvences, kas kodē proteīnus no antocianīnu sintēzes ceļa un noguldītas GenBank.
Informācija publicēta 31.08.2021.
Projekta progress:
2021. gada 1. septembris – 2021. gada 30. novembris
Projekts un rezultāti tika prezentēti pasākumā “The Long night of research”. Virtuāls posteris ar projektā paveikto tika prezentēts 13. Ikgadējā PEGS Europa konferencē. Tika apmeklēts četru dienu FEBS padziļinātais kurss par skaitļošanas pieejām enzīmu katalīzes izpratnei un inženierijai. Darbs turpinājās ar preparātiem antocianīnu dekorējošo enzīmu ekspresēšanai raugā Kluyveromyces marxianus.
Informācija publicēta 30.11.2021.
Projekta progress:
2021. gada 1. decembris – 2022. gada 28. februāris
Tika novērtētas dažādas indukcijas metodes un afinitātes marķējuma atrašanās vietas antocianīnu dekorēšanas enzīmu ekspresijai raugā Pichia pastoris. Ar kodoniem optimizētas proteīnu sekvences tika pasūtītas, lai pārbaudītu Rhodosporidium toruloides raugu kā ekspresijas saimnieku. Golden Gate montāža tika izmantota, lai izveidotu Kluyveromyces marxianus ekspresijas vektorus.
Informācija publicēta 28.02.2022.
Projekta progress:
- gada 1. marts – 2022. gada 31. maijs
Golden Gate montāža tika izmantota, lai izveidotu R. toruloides ekspresijas vektorus. Tika veikti pirmie mēģinājumi pārveidot R. toruloides. Flavonoīdu 3′, 5′-hidroksilāžu (F3’5’H) sekvences no trim Vaccinium sugām tika sapludinātas ar N- vai C-gala polihistidīna marķējumu un ekspresētas P. pastoris. Tika prognozēti Vaccinium F3’5’H strukturālie modeļi un savienoti ar ligandiem. Vairāki ekspresijas promotori tika pastiprināti no K. marxianus genoma DNS.
Informācija publicēta 31.05.2022.
Projekta progress:
- gada 1. jūnijs – 2022. gada 31. augusts
Saīsinātas Vaccinium F3’5’H proteīnu versijas tika izveidotas saskaņā ar prognozētajiem strukturālajiem modeļiem. Pēc tam šie saīsinātie F3’5’H tika izteikti raugā P. pastoris. Tā kā F3’5’H katalītiskajai aktivitātei nepieciešama citohroma P450 reduktāze (CPR), tika veikta homoloģijas meklēšana, lai identificētu iespējamos CPR no pieejamā augu materiāla. Trīs paredzamās CPR sekvences tika veiksmīgi pastiprinātas no saulespuķu (Helianthus annuus) un melleņu (Vaccinium myrtillus) cDNS. Sekos koekspresijas eksperimenti.
Informācija publicēta 31.08.2022.
Projekta progress:
- gada 1. septembris – 2022. gada 30. novembris
Tika izveidoti P. pastoris koekspresijas celmi, kas ekspresēja gan Vaccinium F3’5’Hs, gan CPR. Lai palielinātu F3’5’H audzēšanu, tika pārbaudīti vairāki bagātinātāju līdzekļu papildinājumi. Tika uzsākti F3’5’H aktivitātes testi. Protokols, kas apraksta P. pastoris ekspresijas vektoru, kas kodē higromicīna B rezistences marķieri, konstruēšanu, tika sagatavots publicēšanai vietnē protocols.io. Ekspresijas eksperimenti ar K. marxianus tika pabeigti.
Informācija publicēta 30.11.2022.
Projekta progress:
- gada 1. decembris – 2022. gada 31. decembris
Tika pabeigti proteīna ekspresijas eksperimenti, izmantojot Rhodosporidium toruloides raugu. Tika rakstīti standarta darbības protokoli, populārzinātniski teksti un rakstu manuskripti.
Informācija publicēta 30.12.2022.