Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) darbības programmas “Izaugsme un nodarbinātība” 1.1.1. specifiskā atbalsta mērķa “Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā” 1.1.1.2. pasākums “Pēcdoktorantūras pētniecības atbalsts” ietvaros.

Projekta nosaukums: „Sistēmu un molekulārās bioloģijas metožu pielietošana augu izcelsmes enzīmu identificēšanai un to raksturošanai pielietojumam rūpnieciskos procesos”

Projekta identifikācijas Nr. 1.1.1.2/VIAA/2/18/285

Projekta izpildes termiņš: 36 mēneši (2019. gada 1. janvāris – 2021. gada 31. decembris)

Projekta kopējais finansējums: 133 806,00 EUR

Projekta īstenotājs: Dr. Paulius Lukas Tamošiūnas

Pieaugot sabiedrības bažām par sintētisko krāsvielu kaitīgumu, pētījuma projekta ietvaros paredzēts izstrādāt antociānu kā drošu pārtikas krāsvielu un arī veselīgu piedevu. Ir pamats uzskatīt, ka sintētiskā zilā pārtikas krāsviela bērniem ierosina hiperaktivitāti un alerģiskas reakcijas (Kobylewski, S., & Jacobson, M. F., 2010.). Savukārt tirgus segmentā ir nepietiekams dabiskās zilās krāsas pigmentu daudzums. Pēdējos gados pārtikas krāsvielu rūpniecības tirgus ir strauji palielinājies un sagaidāms, ka tas turpinās pieaugt par 10% līdz 15% gadā (Institute of Food Tehnologists, 2016). Tāpēc ir vērojama komerciāla interese panākt spēcīgus zilās krāsas pārtikas kvalitātes preparātus un uzlabot antocianīnus tādā veidā, ka tos var izmantot kā rūpnieciski ražojamas un tehnoloģiksi stabilas dabiskās krāsvielas. Antocianīni ir apstiprināti lietošanai pārtikā, Eiropā ar marķējumu E163 (Cortez, R., Luna-Vital, D. A., Margulis, D., & Gonzalez de Mejia, E. (2017)). Dažas no problēmām, kas saistītas ar plaši izplatītu antocianīnu kā dabisko krāsvielu izmantošanu, ir to salīdzinošā nestabilitāte šķīdumā, it īpaši pie neitrālā pH un paaugstinātas temperatūras. Pamatojoties uz pašreizējām ģenētiskajām, fitoķīmiskajām un pārtikas pārstrādes zināšanām par antociānu, projekts izveidos un skrīnēs jaunu dabisko krāsvielu ražošanas stratēģiju. Projekta uzdevumos ietilps in siliko alēļu ieguves process genomos, jaunu alēļu izvēle un analīze kombinācijām, kas iesaistīti biosintēzes procesā, lai radītu inovatīvas/jaunas fermentu kombinācijas no dabā sastopamiem biosintetisko enzīmu kandidātiem. Projekta laikā tiks pētītas optimālas enzīmu kombinācijas, lai iegūtu noturīgas krāsas, un iegūtu no dažādām sugām ar antociānu spektru raksturīgās modifikācijas. Jauniegūtās zināšanas tiks izmantotas, lai attīstītu un uzlabotu jaunu dabisko krāsvielu izstrādi un ražošanas pielietojumu rūpnieciskajos procesos.

Informācija publicēta 02.01.2019.

Projekta progress:

2019. gada 1. janvāris – 2019. gada 31. marts

Projekta sākumā literatūrā tika analizēts antocianīnu un citu dabisko zilo krāsvielu biotehnoloģiskās ražošanas pašreizējais stāvoklis. Tika izveidots iespējamais metaboliskais ceļš antocianīnu pamatvielu producēšanai S. cerevisiae raugos no fenolskābju prekursoriem. Četru prekursoru stabilitāte, dažādu raugu celmu augšanas inhibēšana un uzņemšana raugu šūnās tika noteiktas ar masspektromerijas, spektroskopijas un šūnu audzēšanas metodēm. Krāsvielu biosintēzes enzīmu 4-kumārskābes-CoA ligāzes, kalcona izomerāzes, kalcona sintāzes 1 un dihidroflavanola 4-reduktāzes rekombinantai producēšanai raugos tika sagatavoti plazmīdu vektori.

Informācija publicēta 29.03.2019.

Projekta progress:

2019. gada 1. aprīlis – 2019. gada 30. jūnijs

Tika pārbaudīta 4-kumārskabes-CoA ligāzes, kalcona sintāzes 1, kalcona izomerāzes un dihidroflavanol 4-reduktāzes gēnu ekspresija S. cerevisiae un tika apstiprināta iegūto proteīnu stabilitāte. Tika sagatavoti vektori augu izcelsmes dihidroflavanol 4-reduktāzes un UDP-glikozes flavanoid 3-O-glikoziltransferāzes rekombinantai producēšanai raugos. Metabolā ceļa konstruēšanai S. Cerevisiae raugos tika izveidota platforma vairāku gēnu ekspresijai.

Informācija publicēta 28.06.2019.

Projekta progress:

2019. gada 1. jūlijs – 2019. gada 30. septembris

Augu izcelsmes dihidroflavonol 4-reduktāze un UDP-glikozes flavanoīda 3-O-glikoziltransferāze tika pāŗekspresētas raugos un apstiprināta iegūto enzīmu stabilitāte. Lai pārbaudītu policistronsko enzīmu ekspresijas paņēmienu, tika iegūtas rauga S. cerevisiae kultūras, kuras ko-ekspresē 4-kumārskābes-CoA ligāzi un kalcona sintāzi 1. Tika izanalizēti potenciālie gēnu kandidāti antocianīnu dekorējošajiem enzīmiem – acil- un glikozil- transferāzēm.

Informācija publicēta 30.09.2019.

Projekta progress:

2019. gada 1. oktobris – 2019. gada 31. decembris

Dažu rekombinanto enzīmu ekspresijas līmeņa analīze parādīja, ka 4-kumārskābes-CoA ligāze 2 un kalcona sintāze 1 no N. tabacum, bet ne no A. thaliana ir pārekspresētas S. cerevisiae raugā. Tika analizētas dažādas stratēģijas malonil-CoA daudzuma palielināšanai šūnā, kas ir kritiski flavanoīdu sintēzei. Tika testēti molekulārie rīki vienlaicīgai integrācijai raugu genomā un tika izvēlēti integrācijas saiti metaboliskajai inženierijai. Tika sagatavota projekta reportāža nacionālajā televīzijā.

Informācija publicēta 30.12.2019.

Projekta progress:

 2020. gada 1. janvāris – 2020. gada 31. marts

Tika iegūti rauga celmi, kuri ekspresē augu izcelsmes antocianīna sintāzi un flavona 3-hidroksilāzi, flavanoīda 3’5’hidroksilāzes enzīmus. Visu rekombinanto enzīmu ekspresijai tika noteikti optimālie apstākļi. Turpinājās darbs pie uz rauga bāzētas platformas izveides antocianīna sintēzes ceļa gēnu variantu bioķīmiskajai testēšanai optimālai metabolītu plūsmai.

 Informācija publicēta 31.03.2020.

Projekta progress:

2020. gada 1. aprīlis – 2020. gada 30. jūnijs

Tika paredzētas un konstruētas sekvences raugu episomālās komplementācijas ekspresijas sistēmai. Tika konstruēti ekspresijas vektori virknei acil- un glikozil-transferāžu alēļu. Ir identificēti antocianīna sintēzē iesaistīto gēnu mērķa rajoni mutāciju analīzei.

Informācija publicēta 30.06.2020.

Projekta progress:

2020. gada 1. jūlijs – 2020. gada 30. septembris

Turpinājās darbs pie rauga epizomālās komplementācijas ekspresijas sistēmas izveidošanas, ieskaitot genomu integrāciju skrīningu.

Informācija publicēta 30.09.2020.

Projekta progress:

2020. gada 1. oktobris – 2020. gada 31. decembris

Laikā no 23.10.2020. līdz 23.12.2020 pētnieks pavadīja Viļņas Universitātes Dzīvības zinātņu centrā. Vizītes laikā galvenā uzmanība tika pievērsta jaunu CRISPR / Cas9 bāzes rauga genoma ekspresijas modulācijas paņēmienu apguvei. Tika pārbaudīta jaunu CHI, CHS un GT enzīmu variantu izpausme un stabilitāte.

Informācija publicēta 30.12.2020.

Projekta progress:

2021. gada 1. janvāris – 2021. gada 31. marts

Tika ražoti rauga celmi, kas satur epizomiski izteiktus un ar genomu integrētus gēnus naringenīna ražošanai no barotnēs papildinātām aromātiskām skābēm. Tika pētīti audzēšanas apstākļi un celma piemērotība. Dikarboksilskābes plazmas membrānas transportētāju vektori no Schizosaccharomyces pombe un Fusarium graminearum tika ražoti, lai palielinātu prekursora malonāta citoplazmas kopumu.

Informācija publicēta 31.03.2021.

Projekta progress:

 2021. gada 1. aprīlis – 2021. gada 30. jūnijs

Tika izveidota rauga celmu kolekcija, kurā atradās genomā integrēto antocianīna ceļa gēni un papildinošās epizomālās alēles katram no 9 gēniem. Šo jauno celmu audzēšanas apstākļi tika pārbaudīti. Tika sagatavoti SOP vairāku gēnu ekspresijas paneļa modulārai konstruēšanai, ātrai olbaltumvielu ekspresijas skrīningam un raugu kultivēšanai.

Informācija publicēta 30.06.2021.

Projekta progress:

 2021. gada 1. jūlijs – 2021. gada 30. septembris

Aga2 kausēta Vaccinium corymbosum un Lupinus angustifolius antocianidīna 3-O-glikozīda-5-O-glikoziltransferāze (Vc5OGT, Lang5OGT), L. angustifolius antocianidīna 3-O-glikozīds-6 “-O-kumariltransferāze (Lang6OC) un antocianidīna 3-O-glikozīda-6 ”-O-maloniltransferāzes (Lalb6OMT) proteīni tika veiksmīgi sintezēti rauga Saccharomyces cerevisiae EBY100 celmā, un tika pierādīts, ka tie ir pakļauti šūnu virsmai. Salīdzinājumam, tikai Vc5OGT un Lang6OCT sintēze bija veiksmīga kā šķīstošie N’-polistidīna marķētie proteīni S. cerevisiae. Tika veikti sākotnējie visu šūnu inkubācijas testi ar antocianīna ekstraktu.

Informācija publicēta 30.09.2021.

Projekta progress:

2021. gada 1. oktobris – 2021. gada 31. decembris

No 16.6.2021. līdz 31.10.2020. pētnieks pavadīja laiku Viļņas Universitātes Dzīvības zinātņu centrā, kur tika raksturoti rauga celmi antocianīnu ražošanai un modificēšanai. Posteris “Evaluation of Yeast Surface Display System for Synthesis of Anthocyanin-Decorating Enzymes” tika nolasīts 2021. gada 2.-4. novembrī PEGS Europe konferencē. Tika veikta Pa.UFGT un Vc.DFR aktivitāti pastiprinošu punktu mutāciju in silico modelēšana (WP3) un izstrādāti atbilstoši praimeri mutagēzei.

Informācija publicēta 30.12.2021.

Projekta progress:

2022. gada 1. janvāris – 2022. gada 31. marts

Vc.5OGT, Lang.5OGT, Lang.6OCT un Lalb.6OMT fermentu sintēze tika iegūta kā C’-polihistidīna marķēti proteīni S. cerevisiae.  Flavonoidu 3′,5′-hidroksilāzes no Vaccinium corymbosum, Ribes rubrum un Ribes alpinum tika iegūtas kā ar membrānu saistīti C’-polihistidīna marķēti proteīni. Ar S. cerevisiae celmiem, kas ekspresē Nt.4CL2, Pa.CHS un Ath.CHI, tika panākta barotnē papildinātas kumarīnskābes biokonversija par naringenīnu un kvantitatīvi noteikta ar LC-MS.

Informācija publicēta 31.03.2022.

Projekta progress:

2022. gada 1. aprīlis – 2022. gada 30. jūnijs

Tika sagatavoti un iesniegti divi manuskripti: “Uz rauga balstīta sistēma antocianīna ražošanas ceļa alēļu novērtēšanai in vivo” un “Rauga ekspresētas acil- un glikoziltransferāzes antocianīna stabilizācijai augļu sulā”. Projekta rezultāti tika izplatīti kā posteri FEBS3+ (Tallina) un FEMS (Belgrada) konferencēs. Informatīvo pasākumu ietvaros tika sagatavots izglītojošs praktisko darbu materiāls skolēniem (https://biomed.lu.lv/jaunumi/laboratorijas-darbu-materiali-skolam/ )

Informācija publicēta 30.06.2022.