Projekta nosaukums: „Efektīvas pilot-mēroga leghemoglobīna ražošanas tehnoloģijas izstrāde uz rekombinanto Pichiapastoris un Kluyveromyceslactis fermentācijas procesu ar piebarošanu bāzes”
Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 1.1.1.1. pasākuma “Praktiskas ievirzes pētījumi” 5. kārtas ietvaros.
Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.1/21/A/044
Projekta izpildes termiņš: 2022. gada 1. janvāris – 2023. gada 30. novembris
Projekta kopējais finansējums: 540 540,00 EUR
Projekta īstenotājs: Latvijas Valsts koksnes ķīmijas institūts
Sadarbības partneris: Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrs
Projekta zinātniskais vadītājs BMC: Dr. biol. Andris Kazāks
Projekta kopsavilkums:
Alternatīva lopkopībai var būt augu izcelsmes gaļas aizstājēji. Tie ir definēti kā gaļai līdzīga viela, kas izgatavota no veģetāriešiem draudzīgām sastāvdaļām. Augu izcelsmes gaļa atveido īstas gaļas garšu un tekstūru, neizmantojot dzīvnieku izcelsmes produktus. Lai nodrošinātu tradicionālās gaļas unikālo garšu un aromātu,būtisks ir tieši leghemoglobīna proteīns (LegH). Šobrīd visperspektīvākais LegH ražošanas process atbilstošos daudzumos ir fermentācija, izmantojot rekombinantos mikroorganismu celmus, kas tiek saukti par metilotrofajiem raugiem (piemēram, Pichiapastoris), jo izmanto metanolu kā substrātu un rekombinantā veidā var ražot LegH ar metanola-inducējamapromoterapalīdzību. Minēto pētījumu virza divas problēmas, kas ir: (i) gaistošu un viegli uzliesmojošu vielu izmantošana ražošanas procesā un (ii) salīdzinoši augstās pielietojamo substrātu izmaksas. Viena no bioloģiskajām platformām, kas iepriekš netika pētīta LegH ražošanai un var potenciāli pārspēt P. pastoris, ir Kluyveromyceslactis. Minētais organisms var augt uz lētiem substrātiem, piemēram, siera sūkalām, un tam nav nepieciešams izmantot metanolu olbaltumvielu sintēzes indukcijai. Tādejādi BioHeme projekta mērķis ir izstrādāt efektīvas fermentācijas un mērogošanas metodes augu izcelsmes gaļas aizstājēju ražošanai, izmantojot rekombinanto LegH producējošos Pichiapastoris un Kluyveromyceslactis celmus. BioHeme projekta galvenās aktivitātes ir: (i) rekombinanto (LegH ražojošo) P. pastoris un K. lactis celmu iegūšana ar sekojošu hēmasintēzes efektivitātes un tehnoloģiskā potenciāla novērtēšanu, (ii) fermentācijas vides sastāva optimizācija biomasas uzkrāšanās un LegHsintēzes fāzēs diviem minētajiem rekombinantajiem celmiem, (iii) uz modeli bāzētu kontroles sistēmu pielietošana biomasas augšanas ātruma un hemeproteīna sintēzes kontrolei, (iv) fermentācijas procesa mērogošana un pielietojumu ilgtspējības izvērtēšana.
Informācija ievietota 03.01.2022.
Projekta progress:
- gada 01. janvāris – 2022. gada 31. marts
Tika dizainēti gēni un konstruēti attiecīgie vektori sojas leghemoglobīna (LegHb) intracelulārai un sekretorai ekspresijai P. pastoris un K. lactis raugu sistēmās. K. lactis gadījumā LegHb sintēze netika droši pierādīta ne intracelulāri, ne sekretori. P. pastoris šūnās intracelulāri tika konstatēta visai augsta mērķa proteīna sintēze. Tomēr mēģinājumi uzlabot ekspresiju, izmantojot pazeminātu temperatūru, dzelzs jonu klātbūtni un palielinātu kultivēšanas ilgumu nedeva gaidīto rezultātu. P. pastoris tika pierādīta arī sekretorā LegHb proteīna sintēze, tomēr barotnei nebija raksturīgā sarkanbrūnā krāsa. Tādejādi, visticamāk, tas nesatur hēma grupu un līdz ar to nav izmantojams uzstādītajiem mērķiem. Tiek apsvērta citu alternatīvu saimnieku, piemēram, S. cerevisiae izpēte tuvākajā nākotnē.
1. ceturkšņa pārskats par visiem partneriem
Informācija publicēta 31.03.2022.
Projekta progress:
- gada 1. aprīlis – 2022. gada 30. jūnijs
Tika izstrādāta ātra un efektīva sojas leghemoglobīna (LegHb) attīrīšanas metode no Pichia pastoris šūnām. Tika konstatēts, ka pašreizējos apstākļos iegūst ~1 mg LegHb proteīna no 1 g mitru šūnu. Šāds iznākums vērtējams kā vidēji augsts.
Turpinājās mēģinājumi iegūt LegHb produkciju raugā Kluyveromyces lactis. Sākotnēji tika uzskatīts, ka šajā raugā sintēze nav detektējama, tomēr, veicot attīrīšanu pēc izstrādātās shēmas, tika konstatēts neliels LegHb daudzums. Iznākums gan ir krietni zemāks nekā P. pastoris.
Kā alternatīva K. lactis tika dizainēti gēni un konstruēti attiecīgie vektori LegHb intracelulārai ekspresijai Saccharomyces cerevisiae un Hansenula polymorpha raugu sistēmās. Pagaidām abos gadījumos LegHb sintēze nav droši pierādīta. Turpinās ekspresijas apstākļu optimizācija.
2. ceturkšņa pārskats par visiem partneriem
Informācija publicēta 30.06.2022.
Projekta progress:
- gada 1. jūlijs – 2022. gada 30. septembris
Tika izvērtēta sojas leghemoglobīna (LegHb) sintēze raugos S. cerevisiae un H. polymorpha. S. cerevisiae produkcija ir detektējama, taču ievērojami mazāka nekā P. pastoris. Raugā H. polymorpha produkcija nav detektējama vispār. Līdz ar to no visiem testētajiem raugiem P. pastoris ir visperspektīvākais LegHb sintēzei, un turpmākā optimizācija tiks veikta šajās šūnās. Tika izmēģināta kultivēšana pie pazeminātas temperatūras (24°C) un secināts, ka tas nedod pozitīvu efektu. Tāpat tika izmēģināta LegHb kultivēšana glicīna klātbūtnē, kas arī noveda pie produkcijas samazināšanās. Tika salīdzināts LegHb produkcijas līmenis, kultivējot fermentierī bagātajā barotnē un minimālajā ar sāļu piedevām (BSM). Minimālajā barotnē produkcija bija augstāka, tātad turpmākie eksperimenti ar dažādu komponentu pievienošanu tiks veikti minimālajā barotnē. Veikta arī LegHb attīrīšanas optimizācija, lai iegūtu par 90% tīru produktu, kas nepieciešams proteīna precīzai kvantitēšanai.
3. ceturkšņa pārskats par visiem partneriem
Informācija publicēta 30.09.2022.
Projekta progress:
- gada 1. oktobris – 2022. gada 31. decembris
Tika veikta sojas leghemoglobīna (LegH) attīrīšanas optimizācija, iegūstot par vairāk nekā 90% tīru produktu. Tas ļauj precīzi salīdzināt LegH produkcijas apjomu dažādos kultivēšanas procesos. Tika veikta virkne LegH fermentāciju dažāda sastāva minimālajās barotnēs un salīdzināts LegH iznākums 48h pēc metanola indukcijas. Visaugstākais sintēzes līmenis tika konstatēts BSM barotnē. Šajā barotnē tika veikts arī LegH uzkrāšanās kinētikas pētījums. Sintēzes maksimumu LegH sasniedza intervālā 48-72h pēc indukcijas. Šajos apstākļos tiek plānotas nākamās fermentācijas ar audzēšanas apstākļu optimizāciju.
4. ceturkšņa pārskats par visiem partneriem
Informācija publicēta 30.12.2022.
Projekta progress
- gada 1. janvāris – 2023. gada 31. marts
Šajā laika posmā tika apkopoti iegūtie dati par LegH ekspresiju P. pastoris galda 5 L fermentierī. Tika sagatavots publikācijas melnraksts, kuru vēl plānots papildināt un pabeigt nākamajā ceturksnī. Publikācija apkopo LegH ekspresiju, attīrīšanu un iznākumu dažādās minimālajās kā arī bagātajā barotnē. Tika salīdzināts LegH iznākums bagātajā barotnē no audzēšanas kolbās un fermentierī un konstatēts, ka pēdējā gadījumā tas ir ievērojami augstāks. Iegūtie dati sniedz ieskatu un norādes LegH iegūšanai bioreaktorā preparatīvos daudzumos.
5. ceturkšņa pārskats par visiem partneriem
Informācija publicēta 31.03.2023.
Projekta progress:
- gada 1. aprīlis – 2023. gada 30. jūnijs
Apkopoti iepriekšējo bioreaktora kultivācijas eksperimentu dati. Izveidots matemātiskais modelis, kas apraksta rauga P. pastoris biomasas, substrātu, reaktora tilpuma un produkta uzkrāšanās dinamiku kultivācijas procesa gaitā. Balstoties uz izstrādāto modeli, uzsākta substrāta piebarošanas ātruma kontroles programmas izstrāde MATLAB vidē, ar mērķi optimizēt kultivācijas procesa metanola padeves profilu, lai nodrošinātu maksimālu LegH iznākumu. Turpināts darbs pie zinātniskās publikācijas melnraksta. Veikti vairāki eksperimenti sekretorā LegH proteīna raksturošanai un kvantitēšanai.
6. ceturkšņa pārskats par visiem partneriem
Informācija publicēta 30.06.2023.
Projekta progress:
- gada 1. jūlijs – 2023. gada 30. septembris
Turpināts darbs pie kultivācijas procesa matemātiskā modeļa izstrādes, atlasot optimālos modeļa parametrus. Matemātiskā modeļa darbība pārbaudīta reālā kultivācijas procesā, reāllaikā modelējot rauga P. pastoris biomasas, substrātu, reaktora tilpuma un produkta uzkrāšanās dinamiku. Izstrādāta PID kontroles programma, lai kontrolētu metanola piebarošanas ātrumu, nodrošinot šūnu augšanu ar noteiktu specifisko augšanas ātrumu (µ-stat). Uzsākts darbs pie uz neironu tīkliem (artificial neural networks) balstīta procesa modeļa izstrādes, izmantojot no iepriekšējiem kultivācijas procesiem uzkrātos datus. Turpināts darbs pie publikācijas par LegH ieguvi laboratorijas mēroga bioreaktorā dažādās barotnēs.
Informācija publicēta 02.10.2023.
Projekta progress:
- gada 1. oktobris – 2023. gada 30. novembris
Projekta noslēdzošajos divos mēnešos tika apkopoti dati par LegH iegūšanu laboratorijas mēroga bioreaktorā dažādās barotnēs. Salīdzināti LegH iznākumi un secināts, ka visaugstākais sintēzes līmenis ir panākams BMGY bagātajā barotnē (1.77 mg/g WCW) un BSM minimālajā barotnē (1.56 mg/g WCW). Virkne projekta gaitā veikto eksperimentu ar mērķi paaugstināt LegH ekspresiju variējot kultivēšanas apstākļos nebija veiksmīgi. Acīmredzot funkcionāla LegH iegūšanu limitē tādi iekššūnas procesi kā hēma grupas biosintēze, kuru ekspresijas apstākļi praktiski neietekmē. No bioreaktora kultivācijas procesa datiem tika izveidots uz mākslīgo neironu tīkliem (artifical neural network) balstīts matemātiskais sensors šūnu slapjās biomasas noteikšanai, atkarībā no standarta bioreaktora datiem – maisītāja ātruma (apgr./min.), izšķīdušā skābekļa koncentrācijas (%), ieejas gaisa bagātināšanas ar skābekli (%), pievadītās bāzes un substrātu (glicerīna, metanola) daudzuma (mL), un kultūras tilpuma (L). Izveidotā sensora aprēķinātās WCW vērtības uzrādīja labu korelāciju ar procesu eksperimentālajiem datiem ar vidējo kļūdas vērtību 3.72 %.
Iegūtie rezultāti tika apstrādāti un publicēti atklātās pieejas žurnālā Processes (IF 3.5).
Processes 2023, 11(11), 3215; https://doi.org/10.3390/pr11113215
Informācija publicēta 30.11.2023.