Projekta nosaukums: „ Jaunu antimikrobiālu līdzekļu atlase pret grampozitīvo baktēriju sortāzi A”
Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 1.1.1.1. pasākuma “Praktiskas ievirzes pētījumi” 1. kārtas ietvaros.
Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.1/16/A/107
Projekta izpildes termiņš: 2017. gada 1. jūnijs – 2020. gada 31. maijs
Projekta kopējais finansējums: 583 689.55 EUR
Projekta zinātniskais vadītājs: Dr. biol. A. Leončiks
Projekta vispārīgais mērķis ir jaunu antibakteriālo vielu atlase multirezistentu infekciju apkarošanai, kas balstās uz grampozitīvo baktēriju transpeptidēšanas enzīma sortāzes A inhibēšanu. Šādu jaunu antibakteriālu vielu radīšana un raksturošana atbilst Latvijas Viedās specializācijas stratēģijas mērķim (RIS3) atbalstīt zinātnes un tehnoloģiju cilvēkkapitāla attīstībā un jaunu zināšanu radīšanā un paver iespējas stimulēt tādas perspektīvas tautsaimniecības nozares kā farmācijas izaugsmi, jo rezultātā var tikt izveidoti jauni produkti (zāles, antibiotikas) ar augstu pievienoto vērtību.
Projekta ietvaros paredzēts veikt mazmolekulāru inhibitoro vielu skrīningu, strukturālu un biofizikālu raksturošanu, tālāku optimizēto inhibitoru sintēzi un mērķtiecīgu modificēšanu ar gala pārbaudi eikariotu šūnās un dzīvnieku modelī, lai noskaidrotu to specifisko inhibitoro aktivitāti un toksiskumu.
Projekts ir ar saimniecisko darbību nesaistīts, un paredzētais pētījumu veids ir fundamentālie pētījumi.
Projekts atbilst sekojošām zinātnes nozarēm: 1.6 Bioloģiskās zinātnes, 3.4 Medicīnas biotehnoloģija.
Projekts tiks īstenots Latvijas Biomedicīnas pētījumu un studiju centrā, kas ir zinātniska institūcija, kura nodarbojas ar zinātnisko darbību (pētniecību) un iegūto rezultātu izplatīšanu zināšanu un tehnoloģiju pārneses veidā. Otra mērķu grupa, kas tiks atbalstīta projekta ietvaros ir esošais institūta zinātniskais personāls, kas tādejādi cels savu zinātnisko kvalifikāciju. Projekta ietvaros tiks nodrošināta pētniecības rezultātu publiska pieejamība. Projekta īstenošanas rezultātā paredzēts sagatavot un iesniegt trīs zinātniskus rakstus.
Informācija publicēta 01.06.2017.
1.etaps. 2017.g. jūnijs-augusts (3 mēneši)
Projekta sākuma etapā visu trīs grampozitīvo mikroorganismu Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes un Bacillus anthracis sortāzi A (SrtA) kodējošās ģenētiskās konstrukcijas tika izmantotas gēnu pārklonēšanas darbiem, lai iegūtu enzimātiski aktīvus proteīnus, kurus plānots izmantot strukturālajiem pētījumiem, inhibitoro vielu atlasei un raksturošanai. Sākotnēji visi rekombinantie enzīmi tiek iegūti analītiskos daudzumos ar nolūku optimizēt to sintēzi bakteriālā ekspresijas sistēmā, lai tālāk kāpinātu to ieguvi līdz preparatīviem daudzumiem. Paralēli noris darbs, kas saistīts ar iegūto proteīnu hromatogrāfisko attīrīšanu un visu ar to saistīto procedūru optimizēšanu.
Izmantojot pirmos attīrītos SrtA proteīnus, ir uzsāktas sākotnējās pārbaudes ar nolūku optimizēt metodes, ar kuru palīdzību tiks analizētas sortāzes enzimātiskās aktivitātes fluorimetriskajās atlases sistēmās ar iezīmētu FRET peptīda substrātu un potenciālajiem inhibitorajiem savienojumiem, kā arī lai izstrādātu vienotu standartizētu fluorimetrijas datu iegūšanas un apstrādes protokolu. Kā pēdējais, ir uzsākti sagatavošanās darbi, lai noskaidrotu SrtA enzīmu kristalizēšanas apstākļus, kurus tālāk varēs izmantot sortāzes-inhibitoru kompleksu ieguvei un šo struktūru modelēšanai.
Informācija publicēta 31.08.2017.
2.etaps. 2017.g. septembris-novembris (3 mēneši)
Projekta otrajā etapā ir pabeigtas visas sākotnēji ieplānotās Gram+ mikroorganismu sortāzes A ģenētiskā konstrukcijas. Visu šo izveidoto ģenētisko konstrukciju sintēze ir pārbaudīta bakteriālā E.coli ekspresijas sistēmā. Visi proteīni ir iegūti preparatīvos daudzumos, tie ir tikuši hromatogrāfiski attīrīti un tos var sākt izmantot tālāk ieplānotajos darbos kā FRET atlase un struktūru analīze. Tā, viena no šīm sortāzēm, L.monocytogenes SrtA(ΔN58), specifiski izotopiski iezīmēta tiek izmantota struktūras pētījumiem ar KMR. Tāpat, noris darbs, lai noskaidrotu attīrīto SrtA enzīmu kristalizācijas apstākļus.
Izmantojot visas izveidotās sortāžu ekspresijai paredzētās konstrukcijas, pašlaik noris darbs, lai noskaidrotu un optimizētu enzimātiskās aktivitātes apstākļus, kas būs nepieciešams ķīmisko vielu bibliotēku skrīningam. Šim nolūkam enzimātiskās pārbaudes tiek veiktas izmantojot vairākus sortāzes FRET substrātus ar dažādiem fluoroforiem. S.aureus SrtA(ΔN59) visos testos ir uzrādījusi augstu peptīda šķelšanas enzimātisko aktivitāti, kamēr B.anthracis SrtA(ΔN56) un L.monocytogenes SrtA(ΔN58) enzimātiskās aktivitātes optimizācijai būs nepieciešamas izveidot papildus ģenētiskās konstrukcijas ar dažādām gēna N-gala delēcijām.
Informācija publicēta 30.11.2017.
3.etaps. Decembris – Februāris (3 mēneši)
Trešajā posmā tika izveidotas piecas jaunas sortāzi A kodējošas ģenētiskas konstrukcijas, lai uzlabotu FRET analīžu rezultātus, kurus nevarēja sasniegt ar abām esošajām B.anthracis SrtA-N∆56 un L.monocytogenes SrtA-N∆58 rekombinantajām sortāzēm. Visas izotopiski iezīmētās SrtA tiek analizētas, lai noskaidrotu to struktūru un enzīma-inhibitoru mijiedarbības likumsakarības izmantojot KMR spektroskopiju. Paralēli, noris darbs, lai pētītu potenciālo sortāzes inhibitoru modeļsavienojumu saistīšanos un mijiedarbību in silico izmantojot vielu modelēšanas datorprogrammas. Visbeidzot, izmantojot vairākus fluorescenti iezīmētus SrtA substrātus ar dažādu aminoskābju garumu un dažādiem FRET pāriem, ir pabeigtas sākotnējās pārbaudes un ir izvēlēti labākie risinājumi, lai varētu uzsākt mazmolekulāro ķīmisko vielu bibliotēkas skrīningu pret trim dažādām sortāzēm.
Informācija publicēta 28.02.2018.
4.etaps. Marts – Maijs (3 mēneši)
Ceturtajā pārskata periodā ir pabeigtas trīs sākotnēji plānotās Gram+ mikroorganismu sortāzes A bakteriālās ekspresijas un sintezēto proteīnu enzimātiskās pārbaudes, izveidoti trīs optimālākie sortāzes konstrukti un ir uzsākta ķīmisko vielu bibliotēkas pārbaude, lai atlasītu spēcīgākos inhibitorus. Vielu skrīninga procedūru veic izmantojot pirmo no diviem FRET peptīdiem ar Abz fluorescento grupu, kuru paredzēts pielietot šajā perspektīvāko sortāzes inhibitoru atlases posmā. Analizējot iepriekš sintezētos sortāzes A inhibitoru atvasinājumus un zāļu vielu fragmentus, ir raksturotas inhibitoro molekulu saistīšanās reakcijas pie iezīmētās SrtA transpeptidāzes un aprakstītas šīs saistīšanās iespējamās formas. Pavisam ir izdevies noskaidrot piecas dažādas kovalentas un nekovalentas dabas mijiedarbības, kad izvēlētie ligandi saistās ar sortāzes A molekulām, ir noskaidroti konkrēti SrtA aminoskābju atlikumi, kuri piedalās šajās mijiedarbībās, šādas saistības daba, molekulārā ietekme un iedarbības spēks.
Informācija publicēta 31.05.2018.
5.etaps. Jūnijs – Augusts (3 mēneši)
Piektajā pārskata periodā ir izdevies izanalizēt un iegūt sākotnējos datus par mazmolekulārās ķīmisko vielu bibliotēkas sortāzi A inhibējošiem savienojumiem. Kopumā pirmajā atlases kārtā ir noskrīnēti 8000 jauni savienojumi, izmantojot šai atlasei Abz-LPETG-K(DNP) FRET peptīdu un trīs iepriekš sagatavoto Gram+ mikroorganismu B.anthracis, L.monocytogenes un S.aureus sortāzes. Vielu bibliotēkas pārbaude tiek turpināta ar otru FRET peptīdu Dabcyl-LPETG-Edans, pēc kuras pabeigšanas varēs atlasīt labākos sortāzes inhibitorus tālākajām pārbaudēm.
Sortāzes A struktūras pētījumi tika fokusēti uz īpaši sintezētu inhibitoro savienojumu saistīšanās ar SrtA aktīvo centru analīzi, lai izveidotu nekovalentus savienojumus ar augstu afinitāti un selektivitāti. Papildus, izmantojot 2D KMR spektroskopiju, šobrīd tiek modelētas arī visas trīs esošo rekombinanto sortāžu enzīma-inhibitoru kompleksu struktūras.
Informācija publicēta 31.08.2018.
6.etaps. Septembris – Novembris (3 mēneši)
Sestajā pārskata periodā ir pabeigta mazmolekulāro ķīmisko vielu bibliotēkas FRET analīze izmantojot divus fluorescenti iezīmētus substrātus un trīs rekombinantus Gram+ mikroorganismu sortāzi A kodējošos enzīmus. Vielu skrīninga rezultātā ir atlasīti vairāki simti potenciālu sortāzi A inhibējošu savienojumu, kuru īpašības tiks tālāk pārbaudītas dažādās bioloģiskās testa sistēmās, lai detalizēti noskaidrotu to toksiskuma līmeni, virulences un infekcijas kontroles iespējas.
Sortāzes A struktūras pētījumi ir ļāvuši izanalizēt un aprakstīt vairāku spēcīgu nekovalentu un kovalentu SrtA inhibitoru saistīšanās mehānismus, tai skaitā precīzi identificēt un noskaidrot kopsakarības mijiedarbībām, kādas veidojas starp inhibitorajām molekulām un konkrētiem enzīma aminoskābju atlikumiem, kas ļaus veikt potenciāli labāko inhibitoru tālāku selektīvu uzlabošanu. Tāpat, ir uzņemti 2D un 3D KMR spektri sortāzes A kompleksiem ar trim specifiskiem inhibitoriem savienojumiem, lai iegūtu informatīvi daudzpusīgu strukturālo informāciju. Šos datus arī paredzēts izmantot turpmākajos ķīmiskās modificēšanas pētījumos, lai palielinātu inhibitoro vielu aktivitāti un iedarbības specifiskumu.
Informācija publicēta 30.11.2018.
7.etaps. Decembris – Februāris (3 mēneši)
Septītajā pārskata periodā pēc ķīmisko vielu bibliotēkas skrīninga pabeigšanas ir atlasīta pirmā inhibējošo vielu grupa, kuru veido 600 jauni savienojumi ar relatīvo inhibitoro aktivitāti vismaz 70% (%I) pret vienu vai vairākām sortāzēm A (SrtA). Šīs grupas savienojumi tiek aktīvi pētīti turpmākajos testos, lai tālāk skaidrotu to svarīgākās īpašības, kādām jāpiemīt līdera savienojumiem. Šim nolūkam ir uzsāktas pārbaudes vielu citotoksiskuma un inhibitorās koncentrācijas noteikšanai, infekcijas procesu analīzei šūnu kultūrās kā arī citos sekundāros testos.
Otrs galvenais pētījuma virziens ir saistīts ar vairāku perspektīvāko SrtA inhibitoru tālāku mērķtiecīgu ķīmisku modificēšanu, izmantojot iepriekš iegūtās zināšanas par bakteriālo sortāžu inhibitoru-enzīmu struktūru un savstarpējo mijiedarbību. Tā, no kopumā šobrīd vislabāk raksturotajiem astoņiem kovalentas un septiņiem nekovalentas mijiedarbības inhibitoriem, tālākajiem modificēšanas darbiem ir izvēlēti četri perspektīvi savienojumi, kuru atvasinājumus detalizētāk analizēs dažādos struktūras un bioloģiskajos testos.
Informācija publicēta 28.02.2019.
8.etaps. Marts – Maijs (3 mēneši)
Astotā pārskata perioda ietvaros tika turpināti iesāktie darbi, kur perspektīvākos sortāzes inhibitoros savienojumus tālāk mērķtiecīgi modificēja un jauniegūtos analogus sintezēja daudzumos, kādi nepieciešami tālākām vielu bioloģiskajām un struktūras pārbaudēm. Pavisam šim nolūkam tika izvēlēti četri novatoriski savienojumi, kur katram no tiem, veicot optimizētas ķīmiskās sintēzes, ieguva līdz 10 jauniem atvasinājumiem.
Savukārt, veicot tālāku atlasīto sortāzes inhibitoru analīzi, izmantojot šim nolūkam trīs esošus un trīs jaunus SrtA enzīmus no dažādiem Gram+ mikroorganismiem un divus dažādus FRET modificētus peptīdus, ir izdevies iegūt 30 savienojumu grupu ar relatīvo inhibitoro aktivitāti (%I) vismaz 90% no sākotnējā 600 kandidātvielu skaita, kuru raksturoja zemāka inhibīcija. Visi atlasītie labākie inhibitori, kā arī jauniegūtie modificētie atvasinājumi, tika tālāk detalizēti pētīti, lai izvērtētu potenciālo zāļu kandidātsavienojumu bioloģiskās īpašības. Šim nolūkam tiek veiktas dažādas analīzes, lai noskaidrotu šo vielu spēju inhibēt mikroorganismu dzīvotspēju, šūnu citotoksiskuma pakāpi, patogēnu mikroorganismu adhēzijas spējas un infekcijas attīstību šūnu kultūrā, kā arī spēju iedarboties uz biofilmu veidošanu.
Informācija publicēta 31.05.2019.
9.etaps. Jūnijs – Augusts (3 mēneši)
Devītā pārskata ietvaros tika sintezēti atsevišķi papildus modificēti savienojumi iepriekš raksturotajiem labākajiem inhibitoriem. Šīs aktivitātes ietvaros šādi iegūtos analogos savienojumus salīdzināja savstarpēji kā arī izmantoja, lai skaidrotu to molekulārās mijiedarbības atšķirības ar dažādām sortāzes A molekulām no vairākiem mikroorganismiem.
Otrs galvenais pētījumu virziens ir saistīts ar labāko inhibitoro savienojumu un to papildus sintezēto analogu vispārējām bioloģiskajām pārbaudēm, lai izvērtētu to farmakokinētiskās īpašības un iespējamo potenciālu. Šim nolūkam tiek veiktas pārbaudes, kur tiek noskaidrots savienojumu citotoksiskums, šūnu adhēzijas un antimikrobiālās infekcijas spējas. Papildus, izmantojot vēl trīs iegūtos SrtA enzīmus no trim dažādām Gram+ baktērijām, tiek salīdzināti struktūras dati, lai varētu optimizēt labāko inhibitoru atlasi un izvēlēties savienojumus ar augstāko aktivitāti un specifiskumu.
Informācija publicēta 30.08.2019.
10.etaps. Septembris – Novembris (3 mēneši)
Desmitā pārskata ietvaros tika sintezēti vairāki papildus modificēti atvasinājumi agrāk atlasītajiem perspektīvākajiem inhibitorajiem savienojumiem. Šos savienojumus tālāk analizēja, lai raksturotu to inhibitorās spējas un iegūtos bioloģiskos un struktūras datus salīdzināja ar visām projektā izmantotajām SrtA transpeptidāzēm.
Tāpat projekta ietvaros tika turpināti visi iepriekš iesāktie darbi ar labākajiem inhibitoriem un to analogiem, kur tika noteiktas un salīdzinātas to bioloģiskās un farmakokinētiskās spējas, kādas nepieciešamas zāļu vielu kandidātiem. Šīs pārbaudes ietvēra S.aureus un S.epidermidis infekcijas testus, izmantojot cilvēka adenokarcinomas šūnu līniju. Cits analīzes virziens ietvēra S.aureus, L.monocytogenes un S.epidermidis grampozitīvo celmu, ieskaitot antibiotiku rezistentu celmu, pārbaudes, kurās tika analizēta atsevišķu atlasīto inhibitoru spēja inhibēt biofilmu veidošanās procesus. Šo bioloģisko pārbaužu ietvaros tika turpināti pētījumi, kuros salīdzināja inhibitoro vielu aktivitāti un specifiskumu šūnu adhēzijas procesu modulēšanā, citotoksiskuma efekta mazināšanā un mikroorganismu dzīvotspējas inhibēšanā.
Informācija publicēta 29.11.2019.
11.etaps. Decembris – Februāris (3 mēneši)
Vienpadsmitajā pārskata ietvaros vairākiem modificētiem inhibitoru savienojumiem tika sintezēti papildus atvasinājumi, lai varētu detalizēti raksturot to mijiedarbību ar sortāzes aktīvo centru. Šim nolūkam šos savienojumus analizēja, lai raksturotu to inhibitorās spējas, noteiktu struktūras un bioloģiskos raksturlielumus ar projektā izmantotajām SrtA transpeptidāzēm.
Projekta ietvaros tika turpināti visi iepriekš iesāktie darbi ar labākajiem inhibitoriem un to analogiem, kur tika noteiktas un salīdzinātas to bioloģiskās un farmakokinētiskās spējas, kādas nepieciešamas zāļu vielu kandidātiem. Šīm pārbaudēm izmantoja S.aureus un S.epidermidis infekcijas testus cilvēka adenokarcinomas šūnu līnijai. Cits analīzes virziens ietvēra vairāku grampozitīvo celmu, ieskaitot antibiotiku rezistentu celmu, pārbaudes, kurās tika analizēta atsevišķu atlasīto inhibitoru spēja inhibēt biofilmu veidošanās procesus. Šo bioloģisko pārbaužu ietvaros tika turpināti pētījumi, kuros salīdzināja inhibitoro vielu aktivitāti un specifiskumu šūnu adhēzijas procesu modulēšanā, citotoksiskuma efekta mazināšanā un mikroorganismu dzīvotspējas inhibēšanā.
Informācija publicēta 28.02.2020.
Projekta progress:
2020. gada 1. marts- 2020. gada 31. maijs
Divpadsmitā pārskata ietvaros tika analizēti papildus sintezēti modificēti inhibitori, lai raksturotu to mijiedarbību ar vairāku bakteriālo sortāzes enzīmu aktīvo centru. Šo savienojumu analīze palīdz labāk izprast to inhibitoro potenciālu, kā arī noteikt struktūras un bioloģisko īpašību sakarības dažādām SrtA transpeptidāzēm.
Tāpat projekta ietvaros tika turpināti iepriekš iesāktie darbi ar pašiem labākajiem atlasītajiem inhibitoriem, lai salīdzinātu to bioloģiskās un farmakokinētiskās spējas kā zāļu vielu kandidātiem. Šīm pārbaudēm pielietoja vairākus bakteriālos celmus infekcijas testu veikšanai izmantojot cilvēka adenokarcinomas šūnu līniju. Cits analīzes virziens ietvēra dažādu grampozitīvo celmu, ieskaitot antibiotiku rezistentu celmu, pārbaudes, kurās noteica labāko inhibitoru spēju mazināt biofilmu veidošanos. Visu bioloģisko pārbaužu ietvaros tika tālāk vākta un apkopota informācija, lai salīdzinātu atlasīto inhibitoro vielu antivirulences potenciālu un specifiskumu šūnu adhēzijas procesu modulēšanā, citotoksiskuma mazināšanā un patogēno mikroorganismu dzīvotspējas inhibēšanā.
Informācija publicēta 29.05.2020.