Pētījumi Projekti Visi Projekti
Projekti

Ātrās saites

Daudzziedu airenes raibuma vīrusa kodēto proteīnu struktūru un funkcionālā izpēte

 

 

Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) darbības programmas "Izaugsme un nodarbinātība" 1.1.1. specifiskā atbalsta mērķa "Palielināt Latvijas zinātnisko institūciju pētniecisko un inovatīvo kapacitāti un spēju piesaistīt ārējo finansējumu, ieguldot cilvēkresursos un infrastruktūrā" 1.1.1.2. pasākums "Pēcdoktorantūras pētniecības atbalsts" ietvaros.

Projekta nosaukums: Daudzziedu airenes raibuma vīrusa kodēto proteīnu struktūru un funkcionālā izpēte

Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.2/VIAA/3/19/462

Projekta izpildes termiņš: 36 mēneši (2020. gada 1. marts – 2023. gada 28. februāris)

Projekta kopējais finansējums: 133 304 57.00 EUR

Projekta īstenotājs: Dr. biol. Ina Baļķe

 

Pētījuma zinātniskais mērķis ir, izmantojot Daudzziedu airenes raibuma vīrusu kā pētījuma modeli, lai noteiktu vīrusa kodēto proteīnu strukturālās un funkcionālās īpašības, kas ļaus labāk izprast vīrusu proteīnu lomu tā dzīves ciklā.

Sobemovīrusi ir ss(+)RNS vīrusi, kas inficē gan viendīgļlapjus, gan divdīgļlapjus. Tā kā to genomi ir nelieli (4-4.5 bp) un vienkāršas uzbūves (kodē 5 ORF, nav fragmentēti), tos var izmantot kā modeļobjektus vīrusu izpētē. To genomi ir salīdzinoši labi raksturoti, taču to proteīnu struktūras un jo īpaši to loma un mijiedarbība infekcijas laikā vēl jānoskaidro. Globalizācija, apmaiņa ar inficētu augu materiālu un jaunu kultūraugu šķirņu ieviešana, ir veicinājis vīrusu izplatību. Vairāki šīs ģints pārstāvji ir ekonomiski nozīmīgi patogēni. Projekta ietvaros tiks veikta vīrusa kodēto proteīnu struktūru noteikšana ar X-ray difrakcijas metodi, ja nepieciešams tiks izmantota arī Crio-EM, KMR, lai to īstenotu, ir nepieciešams augstas tīrības un koncentrācijas paraugs. Tāpēc tie tiks ekspresēti baktēriju ekspresijas sistēmā un attīrīti. Funkcionalitātes pētījumos tiks izmantoti protoplasti, kuros ar fluorescējošu proteīnu vai ar tā daļu sajūgtajiem vīrusa proteīniem, tiks pētīta to lokalizācija šūnā, kā arī to savstarpējā mijiedarbība, kā vizualizācijas metodi izmantojot fluoriscento un konfokālo mikroskopus. Iegūtās zināšanas ļaus izprast infekcijas norisē un atslēgas posmos iesaistītos proteīnus un to funkcijas. Savukārt noskaidrojot proteīnu 3D struktūru ir iespējams pēc datu bāzēs esošajiem struktūru analogiem noskaidrot nezināma proteīna funkciju. Šo informāciju var izmantot vīrusu rezistentu augu šķirņu izveidei un citu vīrusu (zīdītāju) pētījumos. Tiks iegūta arī svarīga informācija par vīrusa vektora iespējamo izmantošanu rekombinantu proteīnu ekspresijai augos. Projekts savā ziņā ir unikāls ar to, ka tiks veikti proteīnu-proteīnu mijiedarbību pētījumi protoplastos, kā arī iegūtas 3D struktūra/as mazpētītiem vīrusa proteīniem, sniedzot augstvērtīgu informāciju virusoloģijas nozarei kopumā.

Informācija publicēta 19.02.2020. 

 

Projekta progress

01.03.2020. – 31.05.2020.

Darbības Nr.1 ietvaros ir veikta, iepriekš izveidoto RGMoV 3C serīna proteāzes katalītiskā centra mutanta (Procm) ar un bez transmembranālā domēna (TMD), plazmīdu ekspresijas pārbaude E.coli ekspresijas celmā C2566. SDS-PAA gelā tika analizēts šūnu kopējais lizāts, kā arī pēc šūnu dezintegrācijas nogulsnes un supernatants, lai pārliecinātos par ekspresijas līmeni un proteīnu šķīdību. Tā kā abi Procm varianti ir šķīstošajā frakcijā, tad tika veikta abu proteīnu preperatīva attīrīšana uz Ni2+ afīnās hromatogrāfijas kolonnas, kā arī testēta to papildus attīrīšana uz gelfiltrācijas kolonnas, tīrāka materiāla iegūšanai 3D struktūras noteikšanai. Procm ar TMD tika veikta attīrīšanas apstākļu optimizācija. Ekspresēta katalītiski aktīvā Pro un attīrīta, lai veiktu funkcionalitātes pētījumus. Uzsākts darbs pie P1 proteīna ekspresijas un attīrīšanas no ieslēgumķermeņiem (IB).

Darbības Nr.3 veikta papildus literatūras analīze, lai izveidotu konstrukcijas ar sašķeltajiem fluoriscentajiem proteīniem (sFP) proteīnu mijiedarbības pētījumiem. Uzsākts darbs pie izveidojamo konstrukciju dizaina.

Informācija publicēta 31.05.2020

 

Projekta īstenošanas progress

01.06.2020. – 31.08.2020.

Darbības Nr.1 ietvaros ir izveidota Procm bez TMD attīrīšanas shēma. Procm bez TMD attīrīta preparatīvā daudzumā kristalizācijas eksperimentiem. Turpinās darbi gan pie Procm ar TMD attīrīšanas apstākļu optimizācijas, gan P1 proteīna optimālākās attīrīšanas metodes no IB izstrādes, kā arī pie katalītiski aktīvās Pro funkcionalitātes pētījumiem.

Darbības Nr.2 ietvaros uzsākts darbs pie Procm bez TMD kristalizācijas un ko-kristalizācijas ar peptīdu apstākļu testēšanas.

Darbības Nr.3 ietvaros uzsākts darbs pie sFP proteīnu mijiedarbības pētījumiem paredzēto plazmīdu izveides.

Informācija publicēta 31.08.2020 

 

Projekta īstenošanas progress

01.09.2020. – 30.11.2020.

Darbības Nr.1 ietvaros turpinās darbi gan pie Procm ar TMD attīrīšanas apstākļu optimizācijas, gan P1 proteīna optimālākās attīrīšanas metodes no IB izstrādes. Veikta P16 N-terminālā domēna P10 ekspresija E.coli ekspresijas celmā C2566. Veikta ekspresijas, proteīna šķīdības analīze SDS-PAA gelā. Veikta P10 attīrīšana uz Ni2+ afīnās hromatogrāfijas kolonnas. Veikta P16 ekspresija E.coli ekspresijas celmā C2566. Veikta P16 ekspresijas klonu analīze SDS-PAA gelā. Turpinās darbs pie katalītiski aktīvās Pro funkcionalitātes pētījumiem.

Darbības Nr.2 ietvaros noteikta 3D struktūra Procm bez TMD un bez peptīda. Uzsākts parbs pie P16 N-terminālā domēna P10 kristalizācijas apstākļu testēšanas. Uzsākts parbs pie publikācijas sagatavošanas par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo Pro ar un bez kofaktora.

Darbības Nr.3 ietvaros izveidotas konstrukcijas sFP eksperimentiem. Uzsākts darbs pie sFP konstrukciju ekspresijas pārbaudes E.coli sitēmā.

Informācija publicēta 30.11.2020 

 

Projekta īstenošanas progress

01.12.2020. – 28.02.2021.

Darbības Nr.1 ietvaros darbs tiek turpināts pie P1 refoldinga buferu optimizācijas, kā arī pie Procm ar TMD attīrīšanas apstākļu optimizācijas. Veikta P16 N-terminālā domēna P10 preperatīva ekspresija E.coli un attīrīšana kristalizācijas eksperimentiem. Izveidots jauns ekspresijas vektors katalītiski aktīvajai ∆117Pro ar N-gala 6 histidīnu tagu, ātrākai Pro attīrīšanai. Veikta ∆117Pro ekspresija E.coli ekspresijas celmā C2566, ekspresijas, proteīna šķīdības analīze SDS-PAA gelā, kā arī ∆117Pro attīrīta uz Ni2+ afīnās hromatogrāfijas kolonnas. Uzsākts darbs pie ORFx kodētā proteīna Px ekspresijas konstrukcijas izveides.

Darbības Nr.2 ietvaros uzsakti P10 kristalizācijas apstākļu optimizācijas eksperimenti. Turpinās parbs pie publikācijas manuskripta gatavošanas par iepriekš iegūtajiem kristalizācijas datiem par katalītiski aktīvo Pro ar un bez kofaktora.

Darbības Nr.3 turpinās darbs pie sFP konstrukciju ekspresijas pārbaudes E.coli sitēmā. Veikta literatūras analīze par pieejamajām protoplastu izolēšanas un transfekcijas metodēm.

Informācija publicēta 26.02.2021. 



Mājas lapas izstrādi finansēja ERAF 2.1.1.2. aktivitātes projekts Nr. 2010/0196/2DP/2.1.1.2.0/10/APIA/VIAA/004 "Latvijas biomedicīnas pētījumu integrācija Eiropas zinātnes telpā".